维生素B2代谢稳定FSP1以预防铁死亡

《Nature Structural & Molecular Biology》：Vitamin B2 metabolism promotes FSP1 stability to prevent ferroptosis

本研究通过CRISPR–Cas9基因筛选揭示了维生素B2代谢在稳定铁死亡抑制蛋白1（FSP1）中的关键作用。研究发现，核黄素激酶（RFK）和FAD合酶（FLAD1）催化的FAD合成是FSP1活性和稳定的基础，FAD结合可保护FSP1免于被E3泛素连接酶RNF8介导的泛素-蛋白酶体途径降解，从而增强细胞对铁死亡的抵抗。该工作不仅系统阐明了FSP1丰度的调控网络，也首次将维生素B2代谢与铁死亡抵抗联系起来，为癌症等疾病的治疗提供了新靶点。

　　

维生素B2代谢通过稳定FSP1抑制铁死亡

铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡形式，已成为癌症等疾病有前景的治疗靶点。铁死亡抑制蛋白1（FSP1）是细胞抵抗铁死亡的关键调节因子，其通过还原辅酶Q₁₀（CoQ₁₀）和维生素K发挥自由基捕获抗氧化剂（RTA）的作用，与谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）通路并行，抑制脂质过氧化。尽管FSP1在铁死亡抵抗中至关重要，但调控其表达和稳定性的机制在很大程度上尚未明确。

构建基因组编辑的FSP1^GFP-P2A-BFP报告细胞系

为系统研究FSP1的调控机制，研究人员在U-2 OS骨肉瘤细胞中利用CRISPR–Cas9基因组编辑技术，构建了一个内源性双荧光报告细胞系FSP1^GFP-P2A-BFP。在该细胞系中，FSP1的C末端被内源性标记了绿色荧光蛋白（GFP），其后通过P2A序列连接蓝色荧光蛋白（BFP）。这种设计使得GFP水平反映FSP1蛋白丰度，BFP水平反映FSP1基因转录水平，而GFP与BFP的比值（GFP:BFP）则能指示FSP1的翻译后稳定性。验证实验表明，该报告细胞系中的FSP1–GFP定位正确（部分定位于脂滴和质膜），功能正常，并能响应FSP1抑制剂FSEN1而增加对铁死亡诱导剂RSL3的敏感性。初步实验还发现，蛋白酶体抑制剂MG132能轻微增加GFP:BFP比值，提示FSP1存在基础的泛素-蛋白酶体系统降解。

全基因组遗传筛选鉴定FSP1水平的调控因子

为了在全基因组范围内鉴定调控FSP1丰度的遗传因子，研究者在FSP1^GFP-P2A-BFP报告细胞中进行了CRISPR–Cas9功能缺失筛选。通过流式细胞分选分离GFP^高和GFP^低的细胞群，并分析其单导RNA（sgRNA）的富集情况。在10%的错误发现率（FDR）下，共鉴定出635个FSP1调控因子，其中498个基因的缺失会提高FSP1水平，137个基因的缺失会降低FSP1水平。基因本体（GO）分析显示，这些基因显著富集于硒代半胱氨酸掺入、氧化还原稳态、泛醌生物合成、泛素-蛋白酶体系统等功能类别。通过后续的批量重测筛选验证，结果与全基因组筛选高度一致，确认了筛选的可靠性。

平行遗传筛选揭示FSP1的转录和翻译后调控因子

为了区分调控FSP1的转录机制和翻译后机制，研究团队利用报告系统进行了平行筛选：以BFP为报告基因筛选转录调控因子，以GFP:BFP比值为报告筛选翻译后稳定性调控因子。这些筛选分别在基础条件和亚致死剂量的铁死亡诱导剂RSL3处理下进行。

转录调控筛选（BFP）发现，已知的KEAP1-NFE2L2（NRF2）通路以及NFE2L1是FSP1的转录调控因子。此外，与硒蛋白合成、氧化应激以及蛋白质N末端乙酰化（涉及NatB和NatC复合物）相关的基因簇也显著影响FSP1的转录水平。

翻译后稳定性筛选（GFP:BFP）则鉴定出多个影响FSP1稳定性的基因簇。其中最显著的一类涉及泛素化相关基因，包括E3泛素连接酶UBR4、KCMF1和RNF126，它们的缺失会上调FSP1水平。然而，最引人注目的发现是，核黄素激酶（RFK）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）合酶（FLAD1）的sgRNA在GFP:BFP^低细胞中显著富集，表明它们的缺失会降低FSP1的翻译后稳定性。RFK和FLAD1是维生素B2（核黄素）代谢中的关键酶，负责将维生素B2逐步转化为FAD。

FAD合成促进FSP1稳定性和铁死亡抑制

维生素B2（核黄素）本身并不具备自由基捕获抗氧化活性，这提示其作用机制不同于维生素E、K等。进一步研究发现，在RFK或FLAD1敲除（KO）的细胞中，或在维生素B2缺乏的培养基中培养细胞，都会导致FSP1蛋白水平下降、细胞内的FAD水平降低，并且细胞对GPX4抑制剂RSL3诱导的铁死亡更加敏感。这种铁死亡敏感性可被外源性添加FAD完全挽救，被FMN部分挽救，但添加维生素B2无效，表明FAD的合成对于FSP1的功能至关重要。来自癌症细胞系百科全书（CTRP）的数据也显示，RFK（而非FLAD1）的表达与癌细胞对GPX4抑制剂的抗性呈正相关。

为了深入研究FAD对FSP1稳定性的影响，研究者建立了一个多西环素（Dox）诱导的转录关闭系统。动力学分析表明，在RFK敲除细胞中，野生型（WT）FSP1的半衰期从约24小时大幅缩短至约6小时，而蛋白酶体抑制剂MG132可以完全稳定FSP1，证明FAD缺乏导致FSP1通过泛素-蛋白酶体途径被快速降解。

FAD结合是FSP1稳定所必需的

FSP1是一种FAD依赖的氧化还原酶。已解析的晶体结构显示，FAD通过其核糖醇基团与FSP1的D41、N49和D285等残基相互作用。研究者构建了破坏FAD结合的FSP1点突变体（D41A, N49A, D285N）。体外实验表明，这些突变体几乎完全丧失了结合FAD的能力以及氧化还原酶活性。虽然圆二色谱分析显示突变体的整体折叠未发生巨大变化，但热稳定性略有下降。

在细胞中，这些FAD结合缺陷的FSP1突变体表现出与RFK敲除细胞中WT FSP1类似的特征：蛋白稳定性显著降低（半衰期缩短），并通过蛋白酶体途径降解；同时，它们无法赋予细胞对RSL3诱导的铁死亡的抵抗能力。这些结果综合表明，FAD的结合对于维持FSP1的酶活性和细胞内的蛋白稳定性都不可或缺。

RNF8介导无FAD结合的FSP1的降解

为了鉴定负责降解无FAD结合FSP1的特异性E3泛素连接酶，研究者在FSP1^GFP-P2A-BFP/RFK^KO细胞（即FAD合成缺陷的敏感化背景）中，进行了一项针对泛素化、自噬和溶酶体（UBAL）降解通路基因的CRISPR筛选。筛选结果将E3泛素连接酶RNF8鉴定为关键因子。

验证实验证实，在RFK敲除细胞中，同时敲除RNF8可以显著恢复FSP1–GFP的蛋白水平，延长其半衰期，并减少其多聚泛素化。相反，过表达野生型RNF8（而非其催化失活突变体C406S）会增加FSP1的泛素化和降解。重要的是，RNF8与FSP1的相互作用仅在FAD缺乏的条件下（RFK敲除或表达D285N突变体时）才能被检测到，而在FAD充足的对照细胞中则不能。这些数据表明，RNF8作为一种蛋白质质量控制E3连接酶，特异性地识别并靶向无FAD结合、可能构象改变的FSP1，通过泛素-蛋白酶体途径将其降解。不过，尽管RNF8的缺失稳定了无FAD的FSP1蛋白，但由于其酶活性丧失，并不能恢复细胞的铁死亡抗性。

讨论与意义

本研究通过系统的遗传筛选，绘制了调控FSP1丰度的综合图谱，并揭示了维生素B2/FAD代谢在其中的核心作用。与其他通过直接清除自由基（如维生素E、K、A）来抑制铁死亡的维生素不同，维生素B2通过其活性代谢产物FAD，以“辅因子”的形式发挥作用：FAD的结合是FSP1维持正确构象、酶活性和细胞内稳定性的关键。当FAD缺乏或FSP1无法结合FAD时，蛋白质质量控制机制（特别是由RNF8介导的泛素-蛋白酶体途径）会被激活，导致无功能的FSP1被迅速清除。

这项工作极大地深化了对FSP1调控网络的理解，将细胞代谢状态（维生素B2/FAD水平）与蛋白质稳定性和细胞死亡命运直接联系起来。从转化医学角度看，该发现提示通过饮食或药物干预调节维生素B2/FAD代谢，可能成为一种调节FSP1水平和铁死亡敏感性的新策略，这对于治疗依赖FSP1高表达的癌症（如某些肺癌）或与FAD代谢缺陷相关的罕见病具有潜在意义。同时，鉴定出的RNF8等E3连接酶也为开发靶向降解FSP1的分子胶降解剂提供了新的切入点。