《Antioxidants》：2-Methoxystypandrone from Polygonum cuspidatum Rejuvenates Senescence by Reducing Mitochondrial ROS
Jee Hee Yoon,
Ye Hyang Kim,
Minseon Kim,
Eun Young Jeong,
Yun Haeng Lee,
Ji Ho Park,
Yoo Jin Lee,
So Hun Lee,
Ha Yeon Kim and
Joon Tae Park
+ 4 authors
1. 引言
细胞衰老是一种由多种压力因素（包括氧化应激损伤、端粒缩短和DNA损伤）导致的细胞周期永久性停滞状态。衰老的标志不仅包括细胞周期停滞，还包括细胞器功能的进行性恶化。在这些细胞器中，线粒体在衰老过程中更容易发生功能改变。这种线粒体功能障碍会导致电子从线粒体电子传递链（ETC）中泄漏，从而促进活性氧（ROS）的产生。生理水平的ROS对于宿主防御、细胞内信号通路和维持细胞稳态至关重要。然而，当ROS水平超过生理阈值时，它们会对细胞器造成损伤。ROS对细胞器的损伤被认为是衰老的主要原因之一。因此，开发能够调节线粒体ROS水平的疗法是抗衰老研究的关键策略。
皮肤老化过程复杂，受内外部因素共同影响。导致皮肤老化的主要生物学过程包括黑色素生成和炎症。黑色素生成是黑色素细胞中黑色素的产生过程，主要由ROS介导的损伤激活。ROS通过激活包括小眼畸形相关转录因子在内的转录因子，上调包括酪氨酸酶在内的黑色素生成酶。黑色素合成过程本身会产生额外的ROS，从而加剧氧化应激，损伤细胞结构，并促进角质形成细胞和成纤维细胞的衰老。同时，皮肤中慢性低度炎症，常被称为“炎症性衰老”，是皮肤老化的另一个关键驱动因素。过量的ROS会激活对氧化还原敏感的转录因子，导致促炎细胞因子的持续表达。这种持续的炎症信号会破坏细胞外基质的完整性，导致皱纹形成、弹性降低和整体皮肤恶化。
虎杖（Polygonum cuspidatum）是一种以其有效的抗炎和抗氧化作用而闻名的药用植物。它还通过调节与皮肤健康相关的关键酶来提供显著的皮肤学益处。虎杖的代表性成分包括白藜芦醇苷、大黄素-1-O-β-葡萄糖苷、大黄素-8-葡萄糖苷和2-甲氧基苯醌（2-MS）。最近的研究表明，白藜芦醇苷在虎杖提取物的抗氧化作用中起着关键作用。然而，对其他成分抗氧化特性的研究却很少。大黄素-1-O-β-葡萄糖苷是一种天然存在的蒽醌苷，是大黄素的衍生物，是一种有效的细菌神经氨酸酶非竞争性抑制剂。大黄素-8-葡萄糖苷具有抗病毒作用，并可作为过氧化物酶体增殖物激活受体α/γ的激活剂。2-MS是一种从虎杖根中提取的天然萘醌衍生物，已知具有多种药理活性，包括抗炎、抗癌、抗菌和抗病毒活性。发现比白藜芦醇苷具有更高抗氧化活性的活性成分，将进一步提高现有依赖白藜芦醇苷治疗方案的疗效，并作为与白藜芦醇苷的联合疗法扩展治疗选择。
本研究旨在筛选出虎杖提取物中能最有效降低线粒体ROS的活性成分，并阐明其在“重振”衰老中的机制。
2. 2-甲氧基苯醌抑制衰老成纤维细胞中线粒体ROS的产生
为了筛选出比已知活性成分白藜芦醇苷抗氧化活性更强的虎杖提取物活性成分，研究选取了虎杖的主要成分：大黄素-1-O-β-葡萄糖苷、大黄素-8-葡萄糖苷和2-甲氧基苯醌（2-MS）作为测试对象，并以白藜芦醇苷作为阳性对照。在衰老的人皮肤成纤维细胞中，以8 μM的浓度处理这些化合物，结果显示，与二甲基亚砜（DMSO）对照组相比，白藜芦醇苷显著降低了线粒体ROS水平。然而，大黄素-1-O-β-葡萄糖苷和大黄素-8-葡萄糖苷未能降低线粒体ROS水平。相比之下，2-MS表现出最强的效果，显著降低了线粒体ROS水平，并且其效果优于白藜芦醇苷。这些结果表明，在虎杖提取物的活性成分中，2-MS拥有比白藜芦醇苷更强的抗氧化活性。
为了排除2-MS仅在8 μM浓度下有效的可能性，研究测试了4 μM和12 μM浓度。在所有测试浓度下，2-MS均能显著降低衰老成纤维细胞中的线粒体ROS水平，且降低程度在各浓度间无显著差异。ROS可直接损伤DNA或损伤参与DNA维持的蛋白质。基于2-MS能降低线粒体ROS的发现，研究进一步探讨了2-MS对DNA损伤的影响。通过测量反映损伤程度的DNA彗星尾长发现，在所有测试浓度下，2-MS均能显著减少DNA双链断裂。这些结果证实了2-MS在减少线粒体ROS产生方面的效果。
3. 2-MS恢复线粒体功能
ROS产生的主要原因之一是线粒体电子传递链（ETC）中电子传递的低效。特别是，ETC复合物内受损的电子流会促进氧还原为超氧化物自由基。氧化磷酸化（OXPHOS）的效率通常用作衡量电子传递性能的指标。为了研究2-MS减少ROS的机制，研究通过测量耗氧率（OCR）评估了OXPHOS效率。
在衰老成纤维细胞中，用12 μM 2-MS处理可显著提高OCR，表明OXPHOS效率增强，而4 μM和8 μM浓度则无显著影响。2-MS在低浓度下未能提高OXPHOS效率的发现，促使研究者进一步探究代表低效电子传递的质子泄漏。结果显示，在4、8和12 μM浓度下，2-MS处理均能显著减少衰老成纤维细胞中的质子泄漏，表明电子传递效率提高。
高效的OXPHOS反映了对糖酵解供能的依赖性降低。为了评估糖酵解活性，测量了细胞外酸化率（ECAR）。2-MS处理在所有测试浓度下均能显著降低ECAR，表明其抑制了糖酵解活性，从而降低了对糖酵解的依赖。乳酸是在糖酵解过程中，利用细胞呼吸不需要的多余质子产生的。这个过程被称为乳酸发酵，是一种能量产生有限的低效代谢途径。为了评估2-MS对这一低效途径的影响，测量了基础质子外排率。与DMSO处理的衰老成纤维细胞相比，2-MS处理显著降低了基础质子外排率，表明2-MS抑制了乳酸发酵。
接下来，研究探讨了2-MS对线粒体膜电位（MMP）的影响，MMP会受到ROS诱导的线粒体损伤的影响。2-MS处理显著改善了MMP，表明2-MS通过减少线粒体ROS的产生，有助于恢复MMP。
在确定了2-MS能恢复衰老成纤维细胞线粒体功能后，研究进一步探究了2-MS是否也能调节年轻成纤维细胞的线粒体功能。在高浓度下，2-MS对年轻成纤维细胞的OCR影响与对照组无异，但在低浓度下则显著降低。此外，在所有浓度下，2-MS均未改变年轻成纤维细胞的质子泄漏，表明2-MS对年轻成纤维细胞的电子传递效率影响甚微。关于糖酵解代谢，2-MS在部分浓度下能降低ECAR和基础质子外排率，表明其对糖酵解有一定抑制作用。最后，在年轻成纤维细胞中，2-MS处理并未改变MMP，这可能是因为年轻成纤维细胞由于ROS引起的线粒体损伤极小，已经具有最佳的基底电化学梯度。
4. 2-MS通过线粒体自噬清除功能失调的线粒体
在观察到2-MS在恢复线粒体功能方面的有益作用后，研究进一步探索了其机制。受损的线粒体通过线粒体自噬（一种有助于线粒体质量控制的过程）被清除。因此，研究者假设2-MS通过促进线粒体自噬来恢复线粒体活性。为了验证这一点，他们检测了线粒体与微管相关蛋白1A/1B-轻链3B（LC3B，自噬体的膜蛋白）的共定位情况，因为线粒体自噬通过自噬体选择性清除功能失调的线粒体。
2-MS处理显著增加了LC3B与线粒体的共定位。为了进一步验证2-MS在线粒体自噬中的作用，使用了氯喹（CQ）。CQ破坏溶酶体pH值，导致自噬体积累和LC3B-线粒体共定位增加。与这一机制一致，CQ处理的细胞表现出明显的共定位增加。值得注意的是，与CQ和DMSO共处理的组相比，CQ和2-MS共处理的组显示出共定位的显著增加。这些结果表明2-MS激活了线粒体自噬。
接下来，测量了自噬通量以评估2-MS对线粒体自噬的激活。自噬通量定义为自噬清除受损细胞器（如线粒体）的速率。在2-MS处理的衰老成纤维细胞中，自噬通量显著增加。这些结果为2-MS促进线粒体自噬激活提供了定量证据。
由于观察到2-MS介导的自噬通量增加，研究测量了线粒体质量，以评估受损线粒体是否也因自噬增加而被清除。在2-MS处理的衰老成纤维细胞中，线粒体质量显著降低。为了确定2-MS是否影响线粒体动力学，研究检测了参与线粒体分裂和融合的关键蛋白的表达。与DMSO对照组相比，2-MS处理并未改变线粒体分裂诱导GTP酶动力蛋白相关蛋白1（Drp1）的表达水平。此外，2-MS也不影响关键融合蛋白的表达，包括外膜GTP酶线粒体融合蛋白1和内膜GTP酶视神经萎缩蛋白1（OPA1，包括长链和短链形式，L-OPA1和S-OPA1）。综合来看，这些结果表明2-MS并不调节线粒体分裂或融合，而是通过促进线粒体自噬来进行线粒体质量控制。
5. 2-MS改善衰老相关表型
线粒体活性的恢复对于重振衰老细胞至关重要。在衰老过程中，脂褐质（一种由铁催化氧化形成的交联蛋白质残基）会在溶酶体中积累。为了确定2-MS是否能“重振”衰老，研究检测了其对脂褐质水平的影响。通过测量自发荧光来评估细胞内脂褐质的积累。2-MS处理的衰老成纤维细胞表现出显著降低的自发荧光，表明2-MS有效抑制了脂褐质积累。然而，2-MS对自发荧光的影响并非剂量依赖性。
接下来，评估了2-MS对衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性的影响，SA-β-Gal是细胞衰老的标志。与DMSO对照组相比，2-MS处理以剂量依赖的方式显著降低了SA-β-Gal阳性细胞的比例。
细胞衰老的特征是由ROS诱导的DNA损伤和蛋白质氧化引发的不可逆细胞周期停滞。由于p16抑制CDK4/6活性并阻止细胞周期从G1期进入S期，研究评估了2-MS处理后p16的表达。2-MS处理的衰老成纤维细胞表现出显著降低的p16表达，表明2-MS缓解了细胞周期停滞。然而，2-MS对p16表达的影响并非线性剂量依赖，而是表现出双相、钟形响应曲线。
2-MS显著降低p16表达的发现，促使研究者探究2-MS对细胞增殖的影响。与DMSO对照组相比，2-MS处理显著增加了细胞增殖，证实了2-MS诱导的p16表达降低。
衰老相关分泌表型（SASP）的特征是衰老细胞分泌细胞因子和趋化因子。在线粒体基质中，ROS与线粒体超氧化物歧化酶相互作用产生过氧化氢（H2O2）。这种H2O2可以扩散穿过线粒体外膜，损伤细胞质蛋白，并促进包括促炎趋化因子CXCL12在内的SASP因子的释放。2-MS处理的衰老成纤维细胞显著降低了CXCL12的表达，表明2-MS下调了炎症性SASP。然而，与p16类似，2-MS对CXCL12表达的影响也表现出非线性的双相、钟形响应曲线。
在观察到2-MS下调炎症性SASP因子后，研究探究了其对抗炎介质的影响。Slit引导配体2（SLIT2）通过核因子κB（NF-κB）信号传导发挥抗炎作用。2-MS处理的衰老成纤维细胞表现出显著增加的SLIT2表达，表明2-MS上调了抗炎因子。
胶原蛋白合成减少会损害皮肤屏障的结构支撑，是皮肤老化的一个标志。为了确定2-MS是否能抑制这一过程，研究检测了I型胶原蛋白α2链（COL1A2）的表达水平。与DMSO对照组相比，2-MS处理显著增加了COL1A2的表达。这些结果表明2-MS促进了胶原蛋白的合成，改善了皮肤的结构完整性。
基质金属蛋白酶1（MMP-1）通过促进胶原蛋白降解来损害皮肤屏障功能。在确认2-MS促进胶原蛋白合成后，研究探究了其对MMP-1表达的影响。虽然4 μM 2-MS未改变MMP-1表达，但8 μM和12 μM浓度显著降低了其表达。这表明在高浓度下，2-MS通过抑制胶原蛋白降解进一步保护了皮肤屏障。
透明质酸酶1（HYAL1）降解皮肤成分透明质酸，导致皮肤屏障功能受损。为了确定2-MS对HYAL1表达的影响，检测了HYAL1的表达水平。与DMSO对照组相比，2-MS处理显著降低了HYAL1表达。
在确认2-MS改善了衰老成纤维细胞的衰老相关表型后，研究进一步评估了其是否调节年轻成纤维细胞中的相同参数。与DMSO处理的年轻成纤维细胞相比，2-MS处理显著降低了自发荧光和线粒体ROS水平，这与在衰老成纤维细胞中观察到的效果一致。然而，2-MS处理并未改变年轻成纤维细胞的线粒体质量，这与在衰老成纤维细胞中观察到的效果不同。此外，2-MS对衰老标志物p16的影响也与在衰老成纤维细胞中不同。虽然基础p16表达在4 μM和12 μM浓度下保持不变，但在中间浓度8 μM时诱导了显著上调。最后，2-MS在所有测试浓度下一致地抑制了CXCL12表达并上调了SLIT2表达，这与在衰老成纤维细胞中观察到的效果完全一致。
6. 2-MS抑制ROS驱动的黑色素生成和炎症反应
基于2-MS在成纤维细胞中改善衰老的效果，研究进一步探究了这些益处是否扩展到其他皮肤细胞。在人永生化角质形成细胞（HaCaT）中，用过氧化氢（H2O2）人工诱导氧化应激。H2O2处理显著增加了细胞内ROS水平。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作为阳性对照，有效抑制了H2O2诱导的ROS积累。值得注意的是，2-MS处理显著降低了H2O2处理的HaCaT细胞中的ROS水平，证明了其在皮肤细胞中的抗氧化活性。
黑色素是决定肤色的色素，在特殊的黑色素细胞中合成。过量的ROS可通过过度激活酪氨酸酶（黑色素产生的关键酶）导致色素沉着过度。为了研究2-MS对黑色素生成的影响，使用了小鼠黑色素瘤来源的黑色素细胞模型B16-F1细胞。用α-黑色素细胞刺激素（α-MSH）诱导黑色素生成，其显著增加了黑色素的产生。已知的黑色素生成抑制剂熊果苷作为阳性对照，显著抑制了α-MSH诱导的黑色素产生。在α-MSH刺激的B16-F1细胞中，2-MS处理仅在最高测试浓度1 μg/mL（3.84 μM）下显著减少黑色素产生，而较低剂量则无效。这些发现表明，需要达到特定的2-MS浓度阈值才能有效抑制黑色素生成。
黑色素体从黑色素细胞向角质形成细胞转移的速率（即黑色素释放速率）与黑色素产生成正比。因此，测量黑色素释放可以间接评估黑色素合成。为了诱导黑色素生成，用α-MSH处理B16-F1细胞，其显著增加了黑色素释放。作为阳性对照的熊果苷显著抑制了α-MSH诱导的黑色素释放。在α-MSH刺激的B16-F1细胞中，2-MS处理同样仅在最高测试浓度1 μg/mL下显著减少黑色素释放，而较低剂量无效。这些发现表明，需要达到特定的2-MS浓度阈值才能有效抑制黑色素的释放。
皮肤炎症是皮肤老化的主要因素，因为它通过持续的炎症信号损伤组织。一氧化氮（NO）通过促进促炎细胞因子的产生来放大炎症。负责NO合成的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）主要在巨噬细胞等免疫细胞中表达。为了评估2-MS的抗炎作用，用脂多糖（LPS）刺激RAW264.7巨噬细胞以诱导iNOS产生。LPS处理显著增加了iNOS活性。非甾体抗炎药吲哚美辛作为阳性对照，有效降低了LPS诱导的iNOS活性。同样，2-MS处理以剂量依赖的方式降低了LPS刺激的iNOS活性，证明了其抗炎潜力。
7. 讨论与结论
ROS是高活性分子，会损伤细胞器。在OXPHOS过程中，电子可能从复合物I和III泄漏，将氧部分还原形成超氧化物自由基，这是细胞内ROS的主要来源。随着细胞衰老，这些复合物的电子泄漏增加，进一步升高ROS产生，并损伤电子传递链和其他细胞器，形成一个加速衰老的恶性循环。因此，减少线粒体ROS是减轻细胞衰老的关键策略。本研究证明，虎杖提取物的活性成分2-MS能有效降低线粒体ROS的产生。机制上，2-MS通过提高OXPHOS效率、减少质子泄漏来增强电子传递效率，从而恢复线粒体功能并减少对糖酵解的依赖。据我们所知，这是首次表明2-MS可减少线粒体ROS的研究，突出了其作为针对线粒体氧化应激的抗衰老策略基石的潜力。
天然化合物，如绿茶提取物和芦荟，已被证明可作为抗氧化剂并促进胶原蛋白生成，从而减轻皮肤老化。这些化合物因其通常比合成成分引起皮肤不良反应的可能性更小而常被用于化妆品。然而，识别活性成分至关重要，因为天然化合物通常由复杂的混合物组成。选择活性成分可以最大限度地减少皮肤老化配方中包含潜在有毒或不必要化合物的可能性。在本研究中，我们鉴定出2-MS是虎杖提取物的主要抗氧化成分。2-MS是萘醌家族中一种天然存在的蒽醌衍生物。蒽醌衍生物含有羟基和甲氧基，可以贡献电子或氢原子来中和ROS。因此，本研究中观察到的线粒体ROS生成减少可能归因于2-MS的抗氧化特性。2-MS在皮肤细胞模型中降低人工诱导的氧化应激的能力进一步支持了这种效应。重要的是，我们证明了2-MS不仅通过线粒体中的高效电子传递，还由于其增强ROS清除的结构特征来发挥其抗氧化活性。
线粒体自噬对于通过选择性清除受损线粒体来维持细胞稳态至关重要。在渐进性衰老过程中，线粒体自噬效率下降，导致功能失调的线粒体积累，并进一步加速衰老。在本研究中，我们发现2-MS恢复了线粒体自噬活性，证据是2-MS处理后线粒体和自噬体的共定位增加。此外，2-MS增强了自噬通量，促进了受损细胞器（包括有缺陷的线粒体）的清除，为线粒体自噬激活提供了定量证据。线粒体自噬的激活减少了功能失调线粒体的数量，从而降低了线粒体ROS水平。据我们所知，这些发现首次证明了2-MS在衰老成纤维细胞中选择性清除缺陷线粒体，揭示了2-MS介导的减少线粒体ROS生成的新机制。
虽然2-MS有效促进线粒体自噬，但它并不显著影响核心的线粒体动力学，这由关键线粒体分裂（Drp1）和融合（OPA1，线粒体融合蛋白1）蛋白的表达保持不变所证明。因此，2-MS似乎通过靶向清除而非重构线粒体网络来诱导线粒体质量控制。然而，由于适当的质量控制依赖于清除和生物发生之间的平衡，2-MS也可能通过线粒体生物发生因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α（PGC-1α）刺激线粒体生物发生。需要进一步研究2-MS对这些生物发生途径的影响，以完全阐明线粒体质量控制的机制。
ROS介导的氧化应激是皮肤炎症的主要驱动因素，通常与衰老相关分泌表型（SASP）因子的表达升高相关。这些因子破坏局部微环境，促进慢性炎症，从而加速细胞衰老。因此，能够减轻SASP诱导的炎症的干预措施具有重要的治疗意义。在本研究中，2-MS显著降低了关键促炎SASP成分CXCL12的表达，同时增加了抗炎因子SLIT2。2-MS在皮肤细胞模型中减少LPS刺激的炎症进一步支持了这些有益效果。综合来看，这些发现凸显了2-MS在减轻炎症状况方面的治疗潜力。
色素沉着过度是皮肤老化的一个突出视觉标志，主要由ROS介导的酪氨酸酶过度激活驱动。这一途径增加了黑色素生成，导致黑色素细胞产生过量的黑色素。先前的研究表明，抗氧化化合物可以减轻ROS，可能减少黑色素生成。在本研究中，2-MS处理有效降低了黑色素产生和释放的速率，表明总体黑色素合成减少。这些发现表明2-MS有潜力作为皮肤老化的化妆品成分，尽管需要进一步的研究来确认其在体内的功效。
总结
总之，我们证明了2-MS能有效减少衰老成纤维细胞中的线粒体ROS。这种降低ROS的效应是通过增强ETC中的电子传递介导的，从而恢复衰老相关表型。此外，2-MS通过减轻ROS驱动的黑色素生成和炎症反应来改善衰老。这些发现揭示了2-MS通过降低线粒体ROS来“重振”衰老细胞的新机制。这些结果为旨在减轻细胞衰老的治疗或化妆品干预奠定了基础。
