多功能Fe3O4@ZIF-8核壳纳米粒子：一种兼具抗菌与促成骨功能、用于治疗颌骨骨髓炎的新型转化策略

《Pharmaceutics》：Multifunctional Fe3O4@ZIF-8 Nanoparticles with Antibiosis and Osteogenesis for Treatment of Jaw Osteomyelitis Heng Li, Zhiyue Zhang, Yu Wang, Ting Mou, Jiaqi Tian, Chong Huang, Lu Zhao, Zeyang Ge, Dandan Wang and Chunlin Zong + 4 authors

本文创新性地提出并验证了一种多功能纳米平台——Fe3O4@ZIF-8核壳纳米颗粒（NPs），用于治疗临床棘手的颌骨骨髓炎（OM）。该平台巧妙融合了ZIF-8的pH响应性降解特性与Fe3O4的超顺磁性，在酸性感染微环境中智能释放Zn2+发挥强大杀菌作用，并通过静磁场（SMF）协同促进骨再生，为“控感染”与“促修复”并重的临床需求提供了极具前景的一体化解决方案。

　　

引言

颌骨骨髓炎是一种由细菌感染引发的难治性化脓性炎症，其临床挑战在于难以根除的持续性感染、过度骨吸收以及由此导致的骨缺损。现有疗法在同时实现彻底抗菌和有效骨再生方面存在局限。金属有机框架材料ZIF-8因其良好的生物相容性、高比表面积及pH响应性降解释放Zn²⁺的特性，在生物医学领域展现出潜力。四氧化三铁纳米粒子则因其优异的生物相容性、独特的纳米生物学效应及超顺磁性，在骨再生领域应用广泛。本研究旨在构建一种集抗菌与成骨功能于一体的Fe₃O₄@ZIF-8核壳纳米粒子，并联合静磁场刺激，探索其对颌骨骨髓炎的治疗效果与机制。

材料与方法

研究通过共沉淀法成功合成了Fe₃O₄@ZIF-8核壳纳米粒子。采用透射电镜、X射线衍射、X射线光电子能谱等多种技术对纳米粒子进行了形貌、结构、元素组成及磁学性能的表征。通过体外细胞实验评估了纳米粒子的生物相容性及促成骨能力，使用大鼠骨髓间充质干细胞进行CCK-8、活死染色、碱性磷酸酶染色、茜素红S染色以及实时荧光定量PCR和蛋白印迹分析。抗菌活性通过测定最小抑菌浓度、菌落计数、活死细菌染色、结晶紫染色（生物膜）、ONPG水解实验（膜通透性）、蛋白泄漏实验及扫描电镜观察进行评估。为阐明抗菌分子机制，对金黄色葡萄球菌进行了转录组测序分析。最后，通过建立金黄色葡萄球菌感染的SD大鼠颌骨骨髓炎模型，在体内验证了该纳米平台结合静磁场的治疗效果，通过菌落计数、显微CT、组织学染色（H&E、Masson、Giemsa）及免疫荧光/免疫组化等方法进行评价。

结果与讨论

3.1. Fe₃O₄@ZIF-8 NPs的表征

表征结果显示，成功合成了具有清晰核壳结构的Fe₃O₄@ZIF-8纳米粒子，其保留了Fe₃O₄的晶相和ZIF-8的方钠石拓扑结构，并表现出超顺磁性。元素分布分析证实了C、N、O、Fe、Zn元素的均匀分布。离子释放实验表明，Zn²⁺的释放具有显著的pH依赖性，在模拟感染酸性环境（pH 5.0）下呈现快速爆发释放，而在中性及碱性条件下释放缓慢，这为实现感染部位的靶向抗菌提供了基础。

3.2. Fe₃O₄@ZIF-8 NPs的体外生物相容性

细胞实验表明，100 μg/mL的Fe₃O₄@ZIF-8 NPs在与骨髓间充质干细胞共培养时表现出最佳的生物相容性，能显著促进细胞增殖。进一步结合100 mT的静磁场刺激，可协同增强细胞的活力与增殖，因此确定该组合为后续实验的最优条件。

3.3. Fe₃O₄@ZIF-8 NPs的体外成骨效应

成骨诱导实验证明，100 μg/mL Fe₃O₄@ZIF-8 NPs单独使用即具有良好的促成骨分化能力。当其与100 mT静磁场联合应用时，能更显著地上调碱性磷酸酶活性、促进钙结节形成，并增强成骨关键基因（Alp、Ocn、Runx2）和蛋白（ALP、OCN、RUNX2）的表达，表明该组合能有效促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。

3.4. Fe₃O₄@ZIF-8 NPs的体外抗菌效果

抗菌实验显示，Fe₃O₄@ZIF-8 NPs对颌骨骨髓炎常见病原菌（金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌）展现出强大的浓度依赖性杀菌和抑制生物膜形成的能力，对大肠杆菌亦有一定效果。其抗菌机制与破坏细菌细胞膜完整性有关，表现为膜通透性增加、胞内蛋白泄漏以及扫描电镜下观察到的细菌膜表面皱缩、破损。

3.5. Fe₃O₄@ZIF-8 NPs的体外抗菌机制

转录组学分析深入揭示了其抗菌的分子机制。纳米粒子处理导致金黄色葡萄球菌中大量热休克反应相关基因（如dnaK、groEL、ctsR、hrcA等）表达下调。这些基因编码的蛋白（如DnaK、GroEL）是细菌应对环境压力、维持蛋白质稳态的关键。实验证实，纳米粒子释放的Zn²⁺是引发该效应的核心。Zn²⁺首先破坏细菌细胞膜，导致大量Zn²⁺内流；高浓度Zn²⁺进而抑制由HrcA和CtsR转录抑制子调控的热休克反应，致使细菌内蛋白质稳态崩溃，从而丧失抵抗不利应激的能力并最终死亡。使用Zn²⁺螯合剂TPEN可逆转上述抗菌效应及基因表达变化，直接验证了Zn²⁺的中心作用。

3.6. 金黄色葡萄球菌感染颌骨骨髓炎大鼠模型的建立与评估

成功构建了SD大鼠颌骨骨髓炎模型。模型组在术后两周表现出典型的感染特征：体重增长缓慢、局部软组织化脓、细菌载量高、组织学显示大量炎性细胞浸润和细菌定植、显微CT显示广泛骨吸收和死骨形成，证实模型稳定可靠。

3.7. Fe₃O₄@ZIF-8 NPs对金黄色葡萄球菌感染颌骨骨髓炎的治疗效果

体内治疗实验将造模大鼠分为三组：仅用GelMA水凝胶的GM组、载有纳米粒子的GM/NPs组、以及纳米粒子联合静磁场的GM/NPs + SMF组。结果显示，GM/NPs组和GM/NPs + SMF组均能有效清除感染部位的细菌。在骨修复方面，GM/NPs + SMF组效果最为显著：显微CT显示其骨体积分数、骨小梁厚度、骨矿物质密度等参数最高，骨缺损近乎完全愈合；组织学染色可见大量成熟的新生骨组织，且炎性细胞和细菌几乎消失。免疫荧光和免疫组化进一步证实该组骨缺损区成骨标志物OCN和RUNX2的表达最高。主要器官H&E染色未发现明显损伤，表明该治疗策略具有良好的体内生物安全性。

结论

本研究成功构建了多功能Fe₃O₄@ZIF-8核壳纳米粒子平台。该平台在酸性感染微环境中智能释放Zn²⁺，通过破坏细菌膜和抑制热休克反应的双重机制实现高效抗菌；同时，释放的Fe₃O₄纳米粒子在静磁场协同下，能有效促进成骨分化。体内实验证实，该纳米平台联合静磁场能有效清除颌骨骨髓炎模型的持续感染并显著促进骨缺损修复，且具备良好的生物安全性。这项工作为同时解决颌骨骨髓炎治疗中“控感染”与“促修复”两大临床难题，提供了一种极具转化潜力的新型策略。