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这项前瞻性单中心研究揭示了住院COVID-19患者血浆中三种Tau蛋白相关microRNA（miR-92a-3p, miR-320a, miR-320b）的显著失调。研究发现，这些在神经退行性疾病中扮演重要角色的miRNAs，在急性感染期间普遍上调，其中miR-320b的表达与疾病严重程度尤为相关。尽管未在患者队列中发现这些miRNAs与神经丝轻链（NfL）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）等神经损伤经典生物标志物间的显著关联，但该研究仍为探索SARS-CoV-2感染对神经系统的潜在影响及其与神经退行性过程的生物标志物关联提供了新的线索和初步证据。
1. 引言
SARS-CoV-2病毒的全球大流行，不仅引发了严重的呼吸系统疾病，也日益被证实与神经系统疾病（NDs）的发生、进展和恶化存在关联。越来越多的证据表明，COVID-19是一种具有显著神经学影响的系统性疾病，患者可能表现出从脑病、脑血管事件、嗅觉丧失到认知障碍和自主神经功能障碍等一系列急性和亚急性神经系统症状。在感染后持续存在的症状，即“长新冠”或“神经性COVID”（NeuroCOVID）中，认知功能障碍尤为常见，其表现包括注意力受损、短期记忆缺陷等。这提示SARS-CoV-2可能通过炎症、血管和免疫介导的机制影响中枢和周围神经系统。探索神经性COVID和NDs的生物标志物，对于揭示其共同的分子改变和通路至关重要，有助于阐明SARS-CoV-2是否以及在多大程度上促发或加速了神经认知衰退。
研究表明，COVID-19患者血清中神经丝轻链（NfL）水平升高与严重或致命结局相关，NfL已成为评估COVID-19严重程度和神经性COVID的潜在生物标志物。值得注意的是，NfL水平的改变在阿尔茨海默病（AD）和额颞叶痴呆（FTD）等NDs中也有报道。此外，尸检研究显示，从COVID-19康复的个体，其海马体和内嗅皮层中出现了异常聚集的高磷酸化Tau蛋白，并伴有持续的神经炎症，这表明SARS-CoV-2可能影响了Tau蛋白的生物学。实验研究也证实，SARS-CoV-2感染可在神经元模型和K18-hACE2小鼠中诱导病理性的Tau蛋白磷酸化、聚集和亚细胞分布改变，其主蛋白酶（3CLpro）还能切割Tau蛋白并促进其聚集，从而在病毒与Tau蛋白失调之间建立了直接的机制联系。
在表观遗传调控机制中，微小RNA（miRNA）扮演着关键角色。它们是小的非编码RNA，能够转录后调控基因表达，影响内皮功能、免疫激活、氧化应激和神经元稳态等过程。在COVID-19患者中已观察到特定的miRNA表达谱失调。值得注意的是，某些miRNA，包括miR-92a-3p、miR-320a和miR-320b，在实验模型中被证实与神经元结构、细胞骨架调控和Tau蛋白相关的细胞通路有关。最近的研究通过荧光素酶报告基因实验及功能增益与缺失实验证明，miR-92a-3p、miR-320a和miR-320b能够直接与编码Tau蛋白的MAPT转录本相互作用，调控其表达。因此，在本探索性研究中，它们被称为“Tau蛋白相关miRNA”。此外，miR-92a-3p参与内皮激活和血管炎症，而miR-320家族的成员则调控细胞外基质重塑，并与调节血脑屏障通透性的基质金属蛋白酶-9（MMP-9）相关。
基于此，本研究旨在量化住院COVID-19患者血浆中三种Tau蛋白相关miRNA（miR-92a-3p、miR-320a和miR-320b）的水平，并与健康对照组进行比较，同时探索其与疾病严重程度、通气需求、临床结局以及已确立的神经炎症和神经退行性生物标志物的关系。
2. 材料与方法
2.1. 研究人群
本研究是一项在意大利罗马萨皮恩扎大学翁贝托一世医院公共卫生与传染病科进行的回顾性单中心研究，纳入了2020年3月至2021年3月期间入院的COVID-19患者。研究共包括38名住院COVID-19患者（20名男性，18名女性；平均年龄67±14岁）和12名健康对照（HC，6名男性，6名女性；平均年龄60±9岁）。
COVID-19的诊断基于高分辨率肺部计算机断层扫描和鼻咽拭子SARS-CoV-2 RNA检测（RT-PCR）确认。入选患者均为成人，且在入院时无合并症（如高血压、心血管疾病、糖尿病）或持续治疗。根据住院期间是否发生急性呼吸窘迫综合征（ARDS），患者最初被分为重症和非重症两组。随后，根据住院期间所需的最大供氧/通气支持水平，进一步细分为四个亚组：重症组分为有创机械通气（IOT）和无创通气（NIV）亚组；非重症组分为文丘里面罩吸氧（VMK）和室内空气（AA）亚组。另有6名患者在住院期间死亡（死亡组）。此外，还根据入院时是否存在神经系统症状（如意识模糊、晕厥、头痛、感觉异常、脑雾）对患者进行了分层。
2.2. 血浆样本采集与RNA提取
血浆样本采集自肝素抗凝管，离心后分装并储存在-80°C。使用miRNeasy血清/血浆试剂盒从血浆样本中提取总RNA。在提取前，向每个样本中加入外源合成的内参miR-39，以监控提取效率和潜在的技术变异。通过检测溶血相关miRNA，确保样本无显著溶血。为减轻残留肝素对逆转录和PCR扩增的抑制作用，cDNA合成后进行了1:50稀释，再进行实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）。
2.3. miRNA定量与统计分析
使用ID3EAL miRNA qPCR试剂在QuantStudio 5实时PCR系统上进行RT-qPCR。以miR-191-5p作为内参基因，采用2?ΔCt法计算目标miRNA的相对表达量。所有反应均设技术重复。
鉴于样本量较小且数据可能不服从正态分布，统计检验同时采用了参数和非参数方法。组间比较采用Student's t检验和Mann-Whitney U检验，多组比较采用ANOVA和Kruskal-Wallis检验，并使用Benjamini-Hochberg法进行错误发现率校正。采用Spearman相关性检验分析miRNA与神经炎症和神经退行性生物标志物（包括NfL、GFAP、MMP-9等）之间的关联。作为一项探索性研究，亚组比较的p值主要进行描述性解读。
3. 结果
3.1. miRNA表达水平
与健康对照组相比，所有COVID-19患者血浆中的三种miRNA水平均显著升高。其中，miR-320a和miR-92a-3p升高超过五倍，miR-320b升高约四倍。
根据疾病严重程度分层，miR-320a和miR-92a-3p在重症和非重症患者中均显著高于健康对照。而miR-320b仅在重症患者中显示出显著升高，提示其可能与疾病进展相关。
根据通气支持进一步分层分析显示，miR-320a在NIV和VMK组中显著高于对照组，miR-92a-3p在NIV组中也观察到类似模式。miR-320b在各亚组中未达到统计学显著性，但在IOT患者中观察到了升高的趋势。
3.2. 相关性分析
研究人员评估了三种Tau蛋白相关miRNA与已发表的神经炎症和神经退行性生物标志物（包括MMP-9、NfL、GFAP等）之间的潜在关联。在所有COVID-19患者中，无论是按疾病严重程度还是通气需求分层，均未发现三种miRNA与任何生物标志物之间存在统计学上显著的相关性。
然而，有趣的是，在健康对照组中，miR-320a与NfL和MMP-9的循环水平呈正相关。这种关联在COVID-19患者队列中完全消失。
4. 讨论
本研究发现，在COVID-19住院患者中，三种能够调控Tau蛋白表达的miRNA（miR-92a-3p、miR-320a、miR-320b）均发生显著失调。这一发现与此前关于COVID-19中miRNA表达谱和Tau相关通路改变的报道相一致。其中，miR-320b仅在重症患者中显著上调的模式，可能暗示其与疾病进展存在潜在联系，但由于最严重亚组（IOT）患者数量较少，尚不能得出确定性结论。
相关性分析的阴性结果尤为值得关注。三种miRNA在COVID-19患者中均未与NfL、GFAP、MMP-9等经典神经损伤标志物显示出显著关联。而健康对照组中观察到的miR-320a与NfL/MMP-9之间的正相关在患者中消失，这提示SARS-CoV-2感染可能破坏或掩盖了生理状态下miRNA与蛋白之间的精细调控网络。可能的机制包括：急性感染期间强烈的系统性炎症、内皮损伤和组织损伤导致NfL和MMP-9大量释放，这种“饱和效应”可能覆盖了miRNA的转录后调控作用；同时，SARS-CoV-2感染本身可导致miRNA表达、加工和功能靶向的全局性失调。
实验研究表明，miR-320a可直接靶向MMP-9的mRNA抑制其翻译。本研究中患者队列缺乏此关联，可能反映了在SARS-CoV-2感染期间，特别是中重度疾病所特有的、压倒性的炎症环境下，这一调控轴被暂时性破坏。
本研究存在若干重要局限性。首先是样本量较小，尤其在按通气亚组分层后，限制了统计效能。其次，横断面设计无法评估时间动态或因果关系。最重要的是，尽管这些miRNA在实验系统中与Tau通路相关，但本研究并未在队列样本中直接量化总Tau蛋白（t-tau）或磷酸化Tau蛋白（p-tau）的水平。这是由于样本来源于COVID-19第一波疫情期间的紧急临床采集，样本量有限且不可复得，已全部用于本研究中已验证的生物标志物检测。因此，无法在本队列中直接推断Tau病理的存在，任何关于miRNA失调与Tau病理之间潜在机制联系的解读都必须格外谨慎，并完全基于外部文献的支撑。尽管如此，本研究的结果为Tau蛋白相关miRNA在COVID-19中发生失调提供了初步证据，并提示其作为潜在生物标志物值得进一步研究。
5. 结论
总而言之，本研究结果表明，住院COVID-19患者的循环Tau蛋白相关miRNA（miR-92a-3p、miR-320a、miR-320b）水平显著失调，其中miR-320b的上调可能与疾病严重程度相关。然而，在急性感染背景下，这些miRNA与已建立的神经损伤血液生物标志物之间缺乏显著关联，提示SARS-CoV-2感染可能扰乱了生理性的调控网络。这些发现是初步和探索性的，需要在更大规模、前瞻性设计的队列研究中进行验证。未来的研究应采用纵向设计，评估这些miRNA的动态变化是否与神经元或胶质细胞生物标志物的改变相关联，并结合神经影像学和认知随访，以确定它们是否有助于预测长期的神经性COVID结局。克服当前 miRNA 研究在临床转化中面临的挑战，需要通过长期、严谨的研究来充分发掘其在COVID-19及其他病毒性疾病中的诊断和治疗潜力。
