评估益生菌口香糖对牙菌斑微生态的调控作用：一项基于Heyndrickxia coagulans SNZ1969?的随机对照试验

《Nutrients》：Projected Health and Economic Impacts of Achieving the Recommended Dairy Intake in Japan: A Simulation Study of Increased Milk Consumption for Stroke Prevention Ryota Wakayama, Michihiro Araki, Mieko Nakamura and Nayu Ikeda

本研究为一项随机、双盲、安慰剂对照试验，旨在评估通过无糖口香糖递送益生菌Heyndrickxia coagulans SNZ1969?对牙菌斑微生态的调控作用。研究证实，该益生菌在干预期可被有效递送至牙菌斑，并诱导出短暂、适度的微生物群落结构改变，包括特定与口腔菌群失调相关类群的减少以及有益菌的富集，为益生菌作为口腔健康辅助干预策略提供了初步的生态学依据。

　　

1. 引言

人类口腔容纳着一个多样且部位特异的微生物群落，包括细菌、真菌、病毒和古菌。这一平衡生态系统的破坏与龋齿、牙周炎等口腔疾病密切相关。通过益生菌等有益微生物调节口腔微生物组，已成为预防或减轻牙菌斑生物膜菌群失调的一种有前景的辅助策略。临床和实验室研究表明，特定的益生菌株可以拮抗口腔病原体、减少炎症标志物，并有利地改变微生物组成，但报告的效果因菌株、剂量、给药方法和研究设计而异。

给药方式对益生菌在口腔中的局部暴露、滞留时间和生态影响至关重要。口香糖是一种有吸引力的口腔益生菌递送基质，因为它能延长机械分散和唾液混合时间，促进与牙齿表面和齿间缝隙的接触，并且具有较高的患者接受度和依从性。此外，口香糖配方的进步允许加入冻干或微囊化的细胞，同时保持其活性和释放动力学。

Heyndrickxia coagulans（原名Bacillus coagulans）是一种产孢乳酸菌，兼具工业稳定性和良好的安全性。临床证据支持特定菌株的胃肠道益处，新出现的临床前和临床数据表明，某些菌株可以调节微生物群落和宿主反应，这可能与口腔健康相关。在口腔中，H. coagulans 的作用被报道可拮抗变形链球菌（S. mutans）的增殖，减少龋齿发生率；此外，一些研究显示其在维持牙周组织健康和减少阿弗他溃疡愈合时间方面具有有益效果。

尽管对口腔益生菌的兴趣日益增长，但关于其到达牙菌斑并在生物膜内诱导可测量的生态变化的证据仍然有限。很少有随机对照试验直接评估菌株在牙菌斑样本中的特异性检测，并评估纵向微生物组反应。口香糖代表了一个潜在优势的递送系统，因为它增加唾液流量，延长口腔内滞留时间，并促进与牙面的接触。然而，通过口香糖递送的益生菌是否能在牙菌斑中被检测到并调节其微生态，仍未得到充分探索。因此，本研究设计了这项随机、双盲、安慰剂对照试验，旨在评估H. coagulans SNZ1969^?对牙菌斑微生物组组成的生态影响。

2. 材料与方法

2.1. 研究设计

本随机对照试验旨在评估通过无糖口香糖给药的益生菌H. coagulans 在牙菌斑中定植的能力。研究在米兰大学（意大利米兰）生物医学、外科和牙科科学系设计和进行，时间介于2024年9月至2025年4月之间，符合《赫尔辛基宣言》原则。该研究在ISRCTN注册中心注册。

2.2. 样本选择

研究对象为从Perfetti Van Melle S.p.A.（PVM，意大利莱纳特）的员工以及米兰大学牙科卫生和牙科本科课程、儿科牙科研究生专科培训课程的学生中招募的健康成年志愿者。本研究应被视为探索性和假设生成性的。纳入标准为18至64岁的成年人，至少有24颗天然牙（不包括第三磨牙），牙龈指数和菌斑指数评分≤2，刺激唾液流速在1.5至2.0毫升/分钟之间。排除标准包括存在全身性疾病、妊娠或哺乳、药物滥用史、吸烟、使用固定正畸矫治器，以及对研究中使用的口香糖任何成分已知过敏。最终，52名符合条件的受试者被确定并纳入。参与者被随机分为两组（干预组26人，对照组26人）。

2.3. 口香糖生产

研究中使用的所有口香糖均由PVM生产和供应。无糖口香糖（重量2.1克）的配方包含胶基、食品级多元醇（不包括木糖醇）、食品级高强度甜味剂和香料，并加入了所研究的特定益生菌菌株（Heyndrickxia coagulans SNZ1969^?，由Sanzyme Biologics Ltd.提供）。生产过程包括胶基在50°C熔化，依次与多元醇、人工高强度甜味剂和香料混合，形成均匀混合物。冻干益生菌生物质在低于50°C时作为最终成分加入，以保持孢子完整性和活力。在生产过程结束时，每粒口香糖中的益生菌平均计数为5 × 10⁸CFU。对照口香糖在形状、颜色和组成上与测试口香糖相匹配，但不含任何益生菌。

2.4. 口香糖使用

总研究持续时间为七周。所有入组受试者都接受了家庭口腔卫生指导，并在整个研究期间获得了一支手动牙刷和含氟牙膏（1450 ppm F）。参与者被要求在研究期间不使用任何漱口水或其他口腔卫生产品。实验期结构如下：初始两周的洗脱期，随后是四周的干预期，最后是一周的干预后观察期。在四周的干预期内，参与者被指示每天五次（早餐后、上午中段、午餐后、下午中段、晚餐后）食用指定的口香糖，每次至少在刷牙后30分钟。

2.5. 结果评估

随访评估在以下时间点进行：初始两周洗脱期后（T₀）、使用口香糖两周后（T₁）、使用口香糖四周后（T₂）以及干预后观察期结束一周后（T₃）。

评估的主要结果是牙菌斑微生物生态系统的表征。次要结果是基于qPCR检测接受含益生菌口香糖的受试者牙菌斑中的H. coagulans SNZ1969^?。

2.6. 牙菌斑样本DNA提取与qPCR分析

使用无菌拭子从所有牙齿的颊面和舌面收集牙菌斑样本。样本在采样后两小时内运输到实验室，并立即储存在-80°C直至分析。使用QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit^?从牙菌斑样本中提取总DNA。通过实时定量PCR（qPCR）检测和定量H. coagulans SNZ1969^?细胞。检测下限（u.d.l.）确定为<1.3 Log₁₀细胞/ng。

2.7. 通过16S rRNA基因谱分析进行宏分类学分析

对上述提取的DNA进行16S rRNA基因扩增子测序，靶向V3-V4高变区。序列数据使用QIIME 2处理。α-和β-多样性分析在扩增子序列变异（ASV）特征表上进行。α-多样性指标包括观察到的ASV、香农熵、Faith系统发育多样性和Pielou均匀度。β-多样性使用Bray-Curtis、Jaccard、加权UniFrac和非加权UniFrac距离度量进行评估。

2.8. 统计分析

为了评估时间 × 处理对α-多样性指标的影响，使用了基于秩的“双重差分”策略。对于β-多样性度量，提取前两个主坐标（PC1和PC2）并显示在散点图中。使用负二项分布广义线性模型（类似DESeq2的框架）进行差异丰度分析。模型包括时间、处理及其交互作用（时间 × 处理）作为固定效应，而受试者作为区组因子以解释纵向研究设计和重复测量。

3. 结果

3.1. 样本特征

共有52名志愿者（每组26人）开始了2周的洗脱期。干预组有3名参与者被排除。最终，干预组21名参与者和对照组23名参与者完成了研究（脱落率13.5%）。参与者的平均年龄为27.9岁，85.7%为女性。共有11名参与者没有完全遵守口香糖方案。最终分析在完成研究的44名受试者上进行。

3.2. 牙菌斑样本中H. coagulans的存在

通过qPCR分析了总共107个牙菌斑样本，以检测菌株H. coagulans SNZ1969。在对照组，T₀时没有样本呈阳性。在干预组，T₀时一名志愿者呈弱阳性。在干预期间，T₁时71.4%的受试者呈阳性，T₂时61.9%呈阳性；总体而言，76.2%的受试者在T₁–T₂期间至少一次呈阳性。停药一周后（T₃），阳性仅在2名受试者中持续存在。在阳性样本中，目标载量在T₁和T₂的中位值分别为2.3和2.4 Log₁₀细胞/ng。

3.3. 牙菌斑细菌群落结构分析：α-多样性

在牙菌斑α-多样性指标的纵向分析中，时间 × 处理的交互作用在干预期间（T₀→ T₂）显示，干预组和对照组在Faith系统发育多样性上存在显著差异。对于Pielou均匀度，观察到组间差异，干预组的均匀度增加。Faith的PD在两组内部也随时间发生变化，但方向相反。然而，在经过错误发现率（FDR）校正后，没有结果达到q < 0.05。

3.4. 牙菌斑细菌群落结构分析：β-多样性

排序图显示，两个处理组和所有四个β-多样性指标在不同时间点之间存在大量重叠，没有明显的时间聚类。Mann-Whitney U检验未揭示对照组或干预组中任何时间点之间的显著差异。ANOSIM证实了这些发现：全局比较得出的R值接近于零，表明组间分离可忽略不计。

3.5. 牙菌斑细菌群落结构分析：细菌类群

使用具有时间 × 处理交互作用的DESeq2-like模型，识别出与益生菌相关的牙菌斑变化，这些变化在补充结束时（T₂）最为明显，并且在随访时（T₃）更具选择性地持续存在。在T₂，干预组在多个谱系中表现出显著减少。相反，Lachnoanaerobaculum属在干预组中增加。在T₃，变化仍然存在，但更具选择性。总体而言，益生菌补充与许多口腔类群相对丰度的减少（在T₂效果最大，在T₃仍然明显）以及特定共生菌或低丰度类群的选择性富集有关。

4. 讨论

综合qPCR数据表明，通过口香糖施用H. coagulans SNZ1969^?导致大多数受试者在2周内在牙菌斑中检测到细菌DNA，4周时阳性率保持在约62%，停药一周后约10%持续存在。对照组在基线时没有信号，干预组95%的受试者在基线时也没有信号，这表明阳性可归因于干预。然而，5/21的受试者始终呈阴性，指出存在个体间差异。需要谨慎的是，qPCR检测目标DNA而不区分活细胞、孢子或游离DNA；因此，在缺乏活力或代谢证据的情况下，应谨慎使用“定植”一词。关于α-多样性，在主动给药期间，干预组表现出与对照组不同的生态轨迹。然而，尽管T₀→T₂差异达到名义显著性，但未能经受住FDR校正。对于β-多样性，在任何一组中均未检测到显著的时间变化。这种整体群落结构的明显稳定性，尽管存在类群水平的调节，表明益生菌补充可能主要通过精细尺度的组成调整起作用，而非大规模的群落重组。差异分析显示，干预组和对照组之间存在不同的组成轨迹，在给药结束时（T₂）出现广泛、急性的抑制，影响了通常与菌群失调状态相关的目/科，并且在随访时（T₃）更具选择性地持续存在，其特征是与牙周病相关的谱系持续减少以及潜在共生菌的有限富集。观察到的显著个体间差异表明，宿主因素、基线微生物组组成和生态恢复力可能会影响对益生菌补充的反应。此外，大多数信号在停止给药后消失表明，可能需要持续给药以维持生态效应。重要的是，本研究未包括临床口腔健康终点，如龋齿发病率、牙龈炎症或牙周参数。因此，观察到的微生物组变化应被解释为牙菌斑生物膜内的生态变化，而非临床获益的证据。

5. 结论

在这项随机、安慰剂对照研究中，qPCR实验表明，通过口香糖递送的H. coagulans SNZ1969^?在大多数接受治疗的志愿者给药期间达到了可检测水平，停药一周后仍有9.5%持续存在。干预期间的中位载量约为2.3–2.4 Log₁₀细胞/ng，应答者的峰值超过5 Log₁₀细胞/ng，而所有对照样本均为阴性。这些发现支持有效的释放和局部积累，尽管无法确认活力，且个体间差异很大。宏分类学分析表明，干预期间α-多样性发生了短暂的重塑，在β-多样性水平上没有显著的时间依赖性分离。对类群的双重差分推断揭示了益生菌给药结束时（T₂）广泛的耗竭，随访时（T₃）在常与牙周炎相关的谱系中具有选择性的持续性，同时伴有假定共生菌的有限富集。总体而言，数据表明，通过口香糖给药的H. coagulans SNZ1969^?可能会诱导牙菌斑组成发生适度且短暂的生态变化。这些效应在停药后是可逆的，并且考虑到探索性设计和有限的样本量，应谨慎解释。需要在更大、有足够功效的研究中结合活力测定、功能分析和临床终点进行确认，才能得出明确结论。