《Nutrients》：Jabuticaba (Myrciaria cauliflora) Modulates Intestinal Inflammation, Liver Homeostasis, and Brain Gene Expression Along the Gut–Liver–Brain Axis in a DSS-Induced In Vivo Model
Stephanie Michelin Santana Pereira,
Vinícius Parzanini Brilhante de S?o José,
Melissa Y. Huang,
Lívya Alves Oliveira,
Kelly Aparecida Dias,
Júlia D’Almeida Francisquini,
Italo Tuler Perrone,
Ceres Mattos Della Lucia and
Elad Tako
1. 引言
肠道屏障由多种细胞类型以及物理-化学和免疫成分构成。杯状细胞数量减少、黏液层变薄和紧密连接蛋白表达下调，会导致肠道屏障功能障碍，进而可能引发慢性炎症，最终发展为炎症性肠病（IBD）。此外，微生物产物、内毒素和炎症信号可易位至门静脉，从而调节肝脏的炎症和代谢反应，这些反应参与了肝脏疾病的病理生理学。同时，这些信号可以通过循环途径或迷走神经通路到达中枢神经系统，调节神经炎症过程、神经递质平衡和神经元功能，从而参与神经和行为障碍的病理生理。
在各种化学诱导的IBD模型中，硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的模型因其操作简单且能模拟人类IBD的效应而被广泛使用。研究表明，给予DSS可诱导与肠炎相关的临床、宏观和组织学特征，如肠道损伤、绒毛高度降低和杯状细胞密度变化。此外，DSS会增加肠道通透性并诱导促炎细胞因子的产生。因此，这些改变会影响肝脏健康，加重肝脏炎症和纤维化，并增加循环内毒素，后者与小胶质细胞活化、血脑屏障（BBB）功能障碍和神经元信号传导受损有关。
Myrciaria属的果实，如巴西浆果嘉宝果，是酚类化合物的显著来源，特别是花青素、鞣花酸和其他生物活性多酚，在临床前模型中已确立其抗氧化、抗炎和神经保护特性。证据表明，这些化合物通过减少炎性细胞因子表达、调节肠道菌群组成和支持上皮形态来增强肠道屏障功能。在肝脏功能方面，嘉宝果酚类提取物在实验模型中显示出肝保护作用，减少了氧化应激、炎症和组织病理学改变的标志物，这表明它们具有调节肝脏对源自肠道信号反应的能力。在大脑中，这些多酚及其代谢物可能通过减轻神经炎症、改善氧化还原平衡以及调节涉及突触可塑性和神经传递的通路来影响中枢神经系统的健康。
然而，花青素和其他多酚的稳定性和生物利用度仍然是主要的技术挑战。冻干等干燥技术和喷雾干燥等微胶囊化方法已被用于保护这些化合物免受不利条件（pH、温度和胃液）的影响，并提高其释放和生物可及性。因此，比较不同的应用形式（冻干全果、冻干果皮和微胶囊化果皮）有助于研究者确定加工方法是否会改变对肠道、肝脏和大脑的生物学效应。
此外，结合DSS的胚内给药鸡胚模型已被成功用于研究肠道炎症的机制，并在这个高度可控和可重复的发育系统中筛选营养和植物疗法干预措施。这种方法允许肠上皮在孵化前直接暴露于生物活性化合物，从而能够评估早期肠道反应、屏障功能、免疫激活和全身性结果。因此，这个成熟的体内模型代表了一个稳健且符合伦理的平台，可用于探索肠道-肝脏-脑轴的相互作用，并产生可能与人类肠道健康相关的机制性见解。
基于这些考虑，本研究在鸡胚（Gallus gallus）模型中调查了与DSS共同给药的嘉宝果提取物的效果，特别关注肠道-肝脏-脑轴。我们假设，含有嘉宝果（主要是微胶囊化果皮）的处理会减轻DSS诱导的肠道损伤，保护屏障完整性，减少肝组织中炎症反应的激活和脂肪积累，并减轻可能由肠道源性炎症和代谢紊乱触发的神经炎症通路。
2. 材料与方法
2.1. 原材料
Myrciaria cauliflora的果实在收获季节从巴西米纳斯吉拉斯州杰奎里农村地区的生产商处采集。嘉宝果经过清洗消毒，并手工分离为两个不同的部分：全果和果皮。这些部分随后被冷冻干燥，并在刀式研磨机中研磨直至获得均匀的粉末。为了封装嘉宝果中存在的花青素，从先前冷冻干燥的果皮中获得了提取物。
果皮经水乙醇（50% v/v）提取，在22±2°C、180 rpm的恒温摇床中振荡10分钟。然后，提取液在3500 rpm下离心15分钟，上清液经真空过滤，并在40°C下通过旋转蒸发器在减压条件下浓缩20分钟。随后，提取物使用喷雾干燥器进行干燥，以麦芽糊精作为包封剂。干燥流速设定为1 kg/h，样品在45°C下干燥。
2.2. 生物测定
在实验开始前，将冻干嘉宝果全果、冻干嘉宝果果皮和微胶囊化嘉宝果果皮在超纯水（18 MΩ H2O）中以三种不同浓度（1%、5%和10%）稀释，以确定给药浓度，从而保持低于320 Osm的渗透压值，确保鸡胚在注射溶液后不会脱水。选择的剂量为5%。
用于胚内注射的溶液进行了以下分析：总酚含量、单体花青素含量以及抗氧化能力（通过DPPH自由基清除法、TEAC法和FRAP法测定）。
获得受精蛋（n=111）并在康奈尔大学动物科学系家禽养殖场的孵化器中最佳条件（37±2°C，89.6±2%湿度）下孵化。在胚胎孵化的第14天，通过照蛋筛选鸡蛋，丢弃那些未受精、破裂、受污染或胚胎过早死亡的鸡蛋，留下100个可存活鸡蛋。
在孵化的第17天，对鸡蛋称重并随机分配到5个组（n=20/组），确保各组间重量分布相似。鸡蛋分为以下组别：（1）水（18 MΩ H2O）；（2）DSS（1.5%）；（3）嘉宝果全果（5%）+ DSS（1.5%）；（4）嘉宝果果皮（5%）+ DSS（1.5%）；（5）嘉宝果微胶囊化果皮（5%）+ DSS（1.5%）。
分配鸡蛋后，通过照蛋识别羊水，标记注射部位并用70%乙醇消毒。然后，使用垂直插入的19毫米针头，第1组鸡蛋注射1毫升水，第2至5组鸡蛋注射1毫升DSS。第一次给药一小时后，第1组和第2组鸡蛋再注射1毫升水，第3至5组鸡蛋注射1毫升相应的提取物。每次注射后，鸡蛋用70%乙醇消毒并用玻璃纸胶带密封。第二次注射后，将鸡蛋放入孵化篮中，确保每种处理在每个孵化器位置都有同等代表。第21天，每组只有8枚鸡蛋孵化。孵化后（第21天）立即对动物称重并通过暴露于CO2实施安乐死。收集大脑、肝脏、十二指肠、结肠和盲肠内容物。
2.3. 分析
2.3.1. 实时聚合酶链反应（RT-qPCR）
为了评估十二指肠、结肠、肝脏和脑组织中的基因表达，使用TRIzol试剂分离总RNA。提取的RNA随后使用高容量cDNA反转录试剂盒反转录为互补DNA（cDNA）。使用PerfeCTa?SYBR Green FastMix?在实时PCR检测系统上进行定量实时PCR（RT-qPCR）分析。设计引物组以扩增与肠道炎症和屏障相关通路相关的基因；肝脏中的核因子κB（NF-κB）、白细胞介素-1β（IL-1β）、黏蛋白-2（MUC-2）、连接黏附分子2（JAM-2）、闭锁小带蛋白-2（ZO-2）、紧密连接蛋白-1（CLDN-1）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶1（SOD-1）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）；以及大脑中的环氧合酶-2（COX-2）、多巴胺和脑源性神经营养因子（BDNF）。使用β-肌动蛋白作为内参对照对基因表达进行定量，并根据2?ΔΔCt方法计算结果。
2.3.2. 组织形态计量学
对于组织形态计量学分析，安乐死后立即收集肝脏和十二指肠样本，并在处理前在10%中性缓冲福尔马林中固定72小时。将福尔马林固定的组织横向切片以获得适合形态学分析的样本。然后将切片脱水、透明并包埋在石蜡中。制备5 μm厚的连续切片，安装在载玻片上，在二甲苯中脱蜡，并通过梯度乙醇系列再水化。十二指肠样品使用阿利新蓝-过碘酸雪夫（AB-PAS）染色，而肝脏切片用苏木精和伊红染色。
使用配有2.8兆像素数码相机的显微镜捕获图像。十二指肠的形态计量学分析包括测量绒毛（长度、宽度和表面积）、隐窝（长度和宽度）、杯状细胞数量和面积，以及肌层的纵向和环向厚度。绒毛表面积通过将每个绒毛建模为圆柱体来估算。对于结肠，未进行绒毛测量。
对于肝脏样本，使用包含266个点的网格进行组织点计数，量化细胞质和脂滴区域、炎症区域和肝细胞核，每个动物总计1064个点。所有形态计量学分析均使用Image-Pro-Plus?软件进行。
2.3.3. 盲肠细菌
从冷冻的盲肠内容物中分离微生物DNA。材料在仍处于冷冻状态时被精细破碎，并转移到含有玻璃珠和PBS（pH 7.4）的试管中。将样品涡旋3分钟以破碎材料，并在1000×g下离心3分钟。将液相转移至新试管，避免残留固体，并在4°C下以4000×g再次离心10分钟。获得的沉淀用PBS（pH 6.8）洗涤并再次在相同条件下离心。随后，将沉淀重悬于50 mM EDTA中，并与溶菌酶在37°C孵育1小时，以支持细菌细胞壁的酶消化。
在16,300×g离心2分钟并移除上清液后，使用来自Promega Wizard DNA纯化试剂盒的细胞核裂解液进行化学裂解，随后在80°C和37°C顺序孵育。用蛋白质沉淀溶液沉淀蛋白质并通过离心去除。通过向澄清的上清液中加入异丙醇回收DNA，所得沉淀用70%乙醇洗涤，风干并溶解在DNA重悬溶液中。样品在4°C储存过夜，并使用分光光度计测量260/280和260/230吸光度比来评估DNA浓度和纯度。
使用从盲肠样本中分离的微生物DNA对16S rRNA基因片段进行扩增。每个25 μL PCR反应体系使用GoTaq Green Master Mix、无核酸酶水、属特异性引物和模板DNA制备。基于分光光度计测量，DNA输入量标准化为每个反应约1000-1500 ng。反应在热循环仪上运行40个循环，根据引物要求使用50至60°C的退火温度。每次运行都包含一个无模板对照以检测潜在的污染。
通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。在1× TAE缓冲液中制备含有核酸染料的凝胶，倒入托盘中，使其凝固，然后浸入1× TAE中。将每个反应的12 μL等分试样与DNA ladder一起上样到孔中。在避光条件下，在100 V下进行电泳约45分钟。然后在凝胶成像系统上对凝胶成像，并将条带强度量化为信号每单位面积。
2.4. 统计分析
使用Shapiro-Wilk检验评估数据正态性。使用t检验评估DSS组内的差异（DSS × WJ + DSS；DSS × JP + DSS；DSS × JM + DSS）。组间差异（水、DSS、WJ + DSS、JP + DSS和JM + DSS）进行方差分析（ANOVA），然后进行Tukey均值检验。采用p值<0.05。结果以平均值和标准差表示。使用GraphPad Prism?软件进行统计分析和图表构建。
2.5. 伦理方面
康奈尔大学机构动物护理和使用委员会批准了该项目，协议代码为2020-0077。
3. 结果
化学分析确定，冻干嘉宝果果皮（JP）的总酚和单体花青素含量最高，其次是冻干嘉宝果全果（WJ），而微胶囊化提取物（JM）的浓度明显较低。通过DPPH、ABTS和FRAP法测定的抗氧化能力遵循相同的模式，JP表现出最强的活性，WJ为中间值，JM最低。
分析肠道基因表达发现，在十二指肠中，暴露于DSS的动物与水组相比，NF-κB表达显著上调，MUC-2表达降低。用嘉宝果全果、果皮或微胶囊化果皮处理可显著降低NF-κB表达，并增加MUC-2表达。关于上皮屏障完整性的标志物，DSS倾向于降低紧密连接相关基因的表达。所有嘉宝果处理组的CLDN-1表达均显著升高，并且JP+DSS和JM+DSS组的ZO-2表达较单独DSS组有所增加。
在结肠中，DSS给药显著增加了NF-κB和IL-1β的表达。补充所有测试形式的嘉宝果显著降低了这些促炎标志物的表达。关于屏障相关基因的表达，所有嘉宝果干预措施均显著上调了ZO-2，WJ和JM增加了JAM-2表达。仅JM干预增加了CLDN-1表达。
十二指肠纵向肌层的厚度在DSS组显著减少，而嘉宝果处理显示出不同的效果；特别是JP+DSS组相对于DSS组，十二指肠纵向肌层显著增加。绒毛表面积受到影响，具体来说，所有嘉宝果处理均导致绒毛表面积显著增加。与水组相比，DSS组的隐窝长度更长，反映了炎症诱导的增生。施用嘉宝果果皮减弱了这种效应，因为JP+DSS和JM+DSS组的隐窝长度与DSS组相比显著减少。
对于每个绒毛的杯状细胞，所有嘉宝果处理均显著增加了杯状细胞数量。关于每个隐窝的杯状细胞数量，WJ和JM相对于DSS呈现显著增加，表明具有恢复作用。对于杯状细胞面积，仅JM组的面积显著大于DSS组。
在结肠中，DSS给药导致与健康对照组相比，结肠纵向和环向肌层厚度均增加。所有三种嘉宝果处理均有效降低了纵向肌层的厚度，其中JP+DSS和JM+DSS组的效果更明显。此外，JP+DSS和JM+DSS组也降低了环向肌层的厚度。
关于结肠隐窝，DSS暴露导致隐窝深度减少。所有嘉宝果处理均增加了隐窝深度；然而，只有WJ+DSS和JM+DSS组有效增加了隐窝宽度。嘉宝果处理还增加了每个隐窝的杯状细胞数量和杯状细胞面积。
盲肠菌群分析显示，与水组相比，DSS给药降低了大肠杆菌、梭菌、乳杆菌、双歧杆菌和拟杆菌的丰度。对于大肠杆菌，JP+DSS组相对于DSS组显示出额外的减少。对于乳杆菌，JP和JM处理与DSS相比显示出进一步减少。双歧杆菌的结果表明，嘉宝果处理组与DSS直接相比显著降低。拟杆菌的分析表明，JM+DSS组相对于DSS组表现出额外的减少。
至于肝脏基因表达，所有形式的嘉宝果都降低了NF-κB表达，其中JP和JM似乎最有效。另一方面，与水组相比，DSS显著增加了iNOS和CAT的表达。所有嘉宝果处理组均显示出iNOS显著降低，并且JP和JM处理降低了CAT表达。DSS增加了SOD-1表达，而JP和JM处理显示出显著降低。对于GSH-Px，仅JM处理显示出GSH-Px表达显著降低。
肝脏组织的形态计量学分析显示，JM+DSS组与DSS组相比，细胞核面积显著增加。关于肝细胞质，DSS诱导细胞质显著减少，表明结构受损。所有嘉宝果处理组的细胞质面积与DSS组相比均显著增加。脂肪球定量显示，与水组相比，DSS显著增加了肝脏脂质沉积。所有三种嘉宝果处理均显著减少了这些脂质积聚。关于炎性浸润，嘉宝果处理显著减少了这些浸润。
WJ、JP和JM处理降低了COX-2基因表达，并增加了多巴胺基因表达。然而，与水组相比，DSS组观察到BDNF基因表达减少，并且所有三个嘉宝果处理组均表现出BDNF基因表达增加。
4. 讨论
本研究表明，不同形式的嘉宝果（冻干全果、冻干果皮和微胶囊化果皮提取物）能够减轻鸡胚模型中DSS诱导的肠道-肝脏-脑轴改变，表明嘉宝果中的生物活性化合物对炎症和氧化损伤具有重要的保护作用。这些发现支持了最近的证据，表明由于花青素和鞣花单宁含量高，巴西浆果对肠道屏障、肝脏稳态和神经可塑性具有调节作用，特别是在黏膜失衡和肠道通透性增加的情况下。
DSS给药有效诱导了肠道炎症，正如十二指肠和结肠中NF-κB以及结肠中IL-1β表达的显著上调所证明的那样。NF-κB的激活是DSS诱导上皮损伤的中心事件，驱动促炎细胞因子的转录并延续黏膜免疫激活。IL-1β的同时增加进一步反映了炎症小体相关信号和上皮应激，共同导致上皮稳态的破坏。这些分子改变伴随着显著的组织形态计量学变化，包括十二指肠绒毛表面积减少、隐窝深度变浅以及结肠杯状细胞数量减少。总的来说，这些发现证实了强烈的炎症表型和受损的黏膜结构的建立。
与炎症信号传导同步，DSS暴露损害了与上皮屏障完整性相关的标志物，特别是降低了结肠中JAM-2的表达。紧密连接蛋白对于维持细胞旁通透性和防止管腔抗原进入固有层至关重要。它们的下调表明肠道通透性增加，这是炎症性肠病的标志，也是肠道源性系统性信号传导的关键启动因素。有趣的是，尽管在结肠中观察到杯状细胞数量减少，在十二指肠中观察到MUC-2减少，但DSS并未在分子水平上显著改变结肠中MUC-2、ZO-2或CLDN-1的表达。
这种明显的差异可能反映了模型的急性性质，其中黏蛋白相关基因的转录变化可能发生在结构和细胞变化之后。事实上，即使黏液层在炎症刺激下增厚，许多细菌仍能穿透黏液到达肠上皮。这种细菌渗透可能是由于黏蛋白的糖基化和硫酸化减少以及唾液酸酸化增加，共同削弱了黏液屏障的保护功能。同样重要的是要认识到，鸡胚模型中使用的DSS暴露与啮齿动物中常用的经典DSS诱导结肠炎模型有显著不同。在鸡胚系统中，DSS暴露发生在胚胎发育期间且实验周期短，这主要反映了急性上皮反应，而不是通常在哺乳动物结肠炎模型中观察到的慢性炎症过程。
嘉宝果处理显著减轻了DSS诱导的炎症信号传导，在所有测试配方中均降低了十二指肠和结肠中的NF-κB以及结肠中的IL-1β表达。这些效应与嘉宝果多酚（特别是花青素和鞣花酸衍生物）的公认抗炎特性一致，这些物质已知可干扰NF-κB激活和细胞因子产生。除了抑制炎症外，嘉宝果处理还增强了与屏障完整性相关的标志物，增加了十二指肠中的MUC-2、结肠中的JAM-2，以及十二指肠和结肠中相对于DSS组的ZO-2和CLDN-1基因表达。此外，嘉宝果改善了十二指肠的结构标志物，如绒毛表面积增加以及每个绒毛和隐窝的杯状细胞数量增加。这些发现不仅表明嘉宝果抑制了炎症级联反应，而且强化了嘉宝果酚类化合物直接作用以恢复肠上皮的物理和功能完整性的观点。
尽管所有形式都产生了显著益处，但在十二指肠中观察到一些细微差异。冻干果皮在肠道肌
