《International Journal of Molecular Sciences》：Transcriptome-Wide Identification and Development of SSR Markers for Genetic Diversity Studies in Medicinal Polygonatum Species
Wenjuan Huang,
Hui Wang,
Majin Yang,
Changhua Ye,
Zhen Li and
Shengfu Zhong
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本研究基于三种黄精属药用植物的转录组数据，系统开发了SSR分子标记。研究共鉴定出43,217个SSR位点，成功设计了31,703对引物，并筛选出49个高多态性标记用于21份材料的遗传多样性分析。结果显示，黄精属资源具有丰富的遗传变异（平均期望杂合度He=0.763，平均多态性信息含量PIC=0.718），并鉴定出9个核心SSR标记（如FB-9）可有效区分6个黄精物种及种内群体，为黄精属物种的精准鉴定、遗传多样性分析、功能基因挖掘及良种选育提供了宝贵的分子工具资源。
引言：黄精的药用价值与鉴定困境
黄精（Polygonati Rhizoma）是一种药食同源的传统中药材，来源于黄精属的多个物种。该属植物表型复杂，栽培品种间存在显著的形态变异和混杂，仅凭表型特征难以准确鉴定物种。例如，玉竹（P. odoratum）与多花黄精（P. cyrtonema）因叶序和叶片形态相似而难以区分；而滇黄精（P. kingianum）的变种P. kingianum var. grandifolium（PKG）甚至在自然种群中存在多倍性和非整倍体现象，其叶序和叶形在不同生长阶段可变，进一步增加了物种鉴定的难度。此外，冬季地上部分枯萎后，仅依靠根茎形态进行鉴别，而根茎形态受环境影响大，变异显著。因此，开发高效、特异的分子标记，对黄精属药用植物（MPs）进行系统的遗传多样性分析和种质资源鉴定，具有重要科学价值和实际应用意义。简单序列重复（SSR）标记因其快速、高效、精确等优势，已被广泛应用于多种植物的遗传研究中。源自转录组（表达序列标签）的EST-SSR标记，由于位于基因的编码区或相关区域，可能具有更强的功能相关性和表型关联性，是解决上述鉴定难题的有效工具。
结果
1. SSR的鉴定与特征
研究对三种黄精属药用植物（滇黄精、多花黄精、PKG）的根茎进行转录组测序，获得198,752条Unigene。从中共鉴定出47,287个SSR基序，分布在36,842条含有SSR的Unigene中，占全部Unigene的18.54%，SSR频率为23.79%。
在SSR基序类型中，单核苷酸重复（SNR）最为丰富，占59.45%，其中A/T重复占绝对优势（99.47%）。其次是二核苷酸重复（DNR，25.52%），其中AG/CT最为常见（16.73%）。三核苷酸重复（TNR）占13.54%，其中AAG/CTT、AAT/ATT和AGG/CCT是超过2%频率的主要类型。
基于SSR位点的分析显示，SSR被分为八种类型，包括简单的p1至p6型以及复杂的复合重复类型c和c*。其中p1型（单核苷酸重复）最多，占57.88%。有4.25%的SSR位点位于编码区序列内。对TNRs的分析发现，其可翻译为20种不同氨基酸，其中亮氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、丙氨酸和天冬酰胺的编码位点最多。
2. 含SSR的Unigene功能注释
利用七个数据库对含有SSR的36,842条Unigene进行功能注释，有46.83%的Unigene在至少一个数据库中成功注释。NR数据库注释比例最高（33.61%），其中匹配度最高的物种是芦笋。GO分类将Unigene分为细胞组分、分子功能和生物过程三大类。KEGG通路分析将5025条Unigene映射到222条通路中，其中与活性成分生物合成相关的通路被分为十类，而碳水化合物代谢相关的基因数量最多（401个），这与黄精中多糖是主要活性成分的认知相符。
3. SSR标记的开发与遗传多样性分析
研究为43,217个SSR位点设计了引物，其中31,703个位点的引物设计成功。从所有设计的引物中，选择了覆盖八种SSR位点类型的100对引物进行验证，最终得到49对可产生特异性多态性条带的多态性引物。p2型引物的多态性比例最高（65%），而复杂重复类型c*的比例最低（20%）。
利用这49对多态性引物对21份黄精种质资源进行分析。结果显示，共检测到446个多态性等位基因，平均每个位点的等位基因数为9.10，有效等位基因数为4.70。平均期望杂合度和平均多态性信息含量分别为0.763和0.718，其中47对引物的PIC值大于0.5，属于高度多态性标记。平均遗传分化系数为0.307，亚群内近交系数和总体近交系数的平均值均为正，表明这些黄精种质资源在存在群体内近交的同时，群体间也发生了显著的遗传分化，具有较高的遗传多样性。
4. 聚类分析与表型关联
基于Nei氏遗传一致性的UPGMA聚类分析将21份材料分为三个类群。类群I由全部来自中国四川省的10份材料组成，叶片排列不规则，被鉴定为PKG。在遗传一致系数0.87阈值下，该类群可进一步分为三个亚组。类群II由7份材料组成，地理分布较广，叶片呈轮生，包含滇黄精、卷叶黄精、黄精和湖北黄精等物种。类群III包含4份材料，叶片互生，被鉴定为多花黄精。主坐标分析的结果与聚类分析高度一致。
值得注意的是，研究发现3个SSR标记（FB-5、FB-9、FB-49）可以特异性地区分六种不同的黄精资源，而7个标记（FB-4、FB-8、FB-9、FB-57、FB-42、FB-60、FB-98）可以区分PKG的三个亚组。利用这9个核心标记对21份材料进行重新聚类，所得结果与使用全部49个标记的结果相当，预测错误率较低，证明了这套核心标记集的有效性。其中，FB-9标记不仅能区分六个黄精物种，还能揭示PKG的种内变异。功能注释显示，FB-5和FB-49对应的基因分别注释为磷酸葡萄糖变位酶/磷酸甘露糖变位酶和α-半乳糖苷酶，而FB-9对应的基因则编码UDP-葡萄糖4-差向异构酶，这是一种糖代谢和细胞壁生物合成所必需的异构酶。
讨论
1. SSR标记的开发与应用价值
本研究基于多物种转录组数据，开发了大量SSR标记，克服了以往研究多集中于单一物种的局限，提高了多态性标记的获得率。在MPs中，SSR频率为23.79%，SNR占比（59.45%）异常高，且以A/T重复为主，这反映了黄精属SSR的核苷酸组成偏好性。研究强调了开发复杂SSR标记的潜力，在本研究筛选出的9个核心标记中，有4个属于复合SSR类型。
2. 遗传多样性分析与种质资源管理
对21份黄精资源的遗传多样性参数分析表明，其遗传多样性水平高，遗传分化显著。结合聚类分析与表型观察发现，三个类群的划分与叶序（不规则、轮生、互生）高度相关。这凸显了分子标记在揭示表型难以区分的细微遗传变异方面的优势，为黄精属物种的准确鉴定和种质资源管理提供了分子依据。
3. 核心标记筛选与功能关联
本研究筛选出的核心SSR标记，特别是FB-9，在物种和种内水平的鉴别中显示出高效性。更重要的是，大多数核心标记（FB-5、FB-9、FB-49等）的功能注释与碳水化合物代谢相关。这为将SSR标记开发与功能基因（尤其是与主要活性成分多糖合成相关的基因）研究相结合提供了范例，不仅为分子标记辅助育种提供了实用工具，也为深入理解黄精多糖生物合成的分子机制奠定了基础。
结论
本研究从三种黄精属药用植物的根茎转录组中鉴定出大量SSR位点，开发了高多态性的EST-SSR标记，并利用这些标记成功评估了21份黄精种质资源的遗传多样性，揭示了其丰富的遗传变异和显著的种群分化。通过聚类分析，资源被划分为三个与叶序相关的类群。研究筛选出9个核心SSR标记，可有效区分六个黄精物种及滇黄精变种的种内变异。这些标记大多与碳水化合物代谢相关，为黄精属药用植物的基因功能分析、种群遗传学研究、品种鉴定及遗传改良提供了宝贵的分子工具资源和技术支持。
