鉴定与表征黄曲霉红色光受体FphA的功能及其在毒素合成与致病性中的调控作用

《International Journal of Molecular Sciences》：Identification and Characterization of a Red-Light Sensor FphA in Aspergillus flavus Kunzhi Jia, Qianhua Zeng, Shuqi Huang, Fufa Tong, Jingwen Huang and Shihua Wang

本研究首次在产毒真菌黄曲霉（A. flavus）中鉴定出红色光感蛋白FphA，揭示其作为关键光受体，在光照条件下不仅调控分生孢子与菌核的发育，还通过抑制aflS表达来负向调控致癌物黄曲霉毒素B1（AFB1）的生物合成，并影响其对花生、玉米的侵染能力，为控制该真菌的传播和毒素污染提供了潜在新靶点。

　　

鉴定与表征黄曲霉中的红色光传感器FphA

引言

黄曲霉（Aspergillus flavus）作为一种常见的丝状真菌，因其能够产生I类致癌物B型黄曲霉毒素（Aflatoxins, AFs），特别是黄曲霉毒素B₁（AFB₁），而对全球粮食和饲料造成广泛污染，构成严重的经济损失和健康威胁。AF的生物合成受环境因素显著影响，已知水活性、温度和pH等条件均能调控其产生。在真菌生命活动中，光是一个不可忽视的环境信号。在构巢曲霉（A. nidulans）中，红光通过光敏色素A（PhyA）等受体介导，影响着其生长和次级代谢。然而，在黄曲霉中，红光如何感知并调节其生物学过程，特别是与产毒和致病性相关的功能，尚不清楚。本研究旨在鉴定黄曲霉中的红光受体，并深入解析其在孢子发育、毒素合成及致病性中的作用。

结果

2.1. 鉴定FphA为黄曲霉中的红色光传感器

通过同源比对，本研究将一个未表征的假定蛋白G4B84_010091鉴定为黄曲霉中的红光传感器，并将其定义为真菌光敏色素A（FphA）。系统进化树分析显示，黄曲霉的FphA在曲霉属中高度保守，与米曲霉（A. oryzae）的FphA相似性高达98.4%。表达分析表明，与黑暗条件相比，红光处理可诱导fphA的转录水平上调1.6倍，而蓝光则使其下降25%。相应地，FphA蛋白在黑暗和红光条件下高表达。为研究其功能，研究团队成功构建了fphA基因敲除菌株（ΔfphA）和回补菌株（fphA-com）。

2.2. FphA缺失损害分生孢子发育

研究显示，FphA的缺失不影响菌落直径，但显著改变了其表型，暗示FphA参与调控分生孢子形成。具体而言，在红光下，野生型（WT）和回补菌株的分生孢子数量相比黑暗条件有所增加，而这种红光诱导的促进作用在ΔfphA菌株中消失。显微观察发现ΔfphA菌株产孢结构发育不良。同时，调控分生孢子形成的关键转录因子brlA和abaA的表达在ΔfphA中显著下调。这些结果表明，FphA通过调控brlA和abaA的表达，介导了红光对分生孢子发育的促进作用。

2.3. FphA在黄曲霉菌核形成中的作用

在黑暗条件下，ΔfphA菌株产生的菌核数量显著少于WT和回补菌株，且与菌核发育相关的关键基因nsdC和nsdD的表达也显著下调。有趣的是，在红光条件下，不同菌株间的菌核数量及nsdC、nsdD表达无显著差异。研究还发现，红光本身有利于菌核发育，WT菌株在红光下的菌核数量是黑暗中的2.7倍，而ΔfphA菌株在红光下的菌核数量可达黑暗中的7倍。这表明FphA在黑暗中对菌核形成具有促进作用，但在红光下并非必需。

2.4. FphA对黄曲霉毒素生物合成的影响

研究表明，红光能显著诱导WT、ΔfphA和fphA-com菌株产生AFs，这与AF生物合成的正调控因子aflS的上调有关。更为重要的是，无论在黑暗还是红光下，ΔfphA菌株产生的AFs水平均显著高于WT和回补菌株，且其aflS的转录水平也显著上调。这表明FphA通过抑制aflS的表达，负向调控AF的生物合成。

2.5. FphA对黄曲霉致病性的影响

通过感染花生和玉米实验评估致病性。结果显示，ΔfphA菌株在花生上生长较差，产生的分生孢子数量仅为对照菌株的三分之一，致病力减弱。类似表型也在感染的玉米中观察到。然而，ΔfphA感染的花生中AFs水平却升高了，这进一步证实了FphA对AF生物合成的抑制作用。红光处理整体上增强了黄曲霉的致病性。

2.6. 响应调节结构域（RR）对FphA功能至关重要

为探究FphA各结构域的功能，研究构建了五个不同结构域缺失的突变体（fphA^ΔPAS, fphA^ΔGAF, fphA^ΔPHY, fphA^ΔHK, 和 fphA^ΔRR）。其中，响应调节结构域缺失突变体（fphA^ΔRR）的表型与ΔfphA几乎完全一致：其产孢结构发育不良、分生孢子数量减少、brlA表达下调；在黑暗条件下菌核数量减少、nsdC表达下调；AFs产量显著增加、aflS表达上调；对花生和玉米的侵染能力及产孢能力均减弱。这些结果证明，PAS、GAF、PHY、HK和RR结构域对FphA的完整功能均很重要，而RR结构域在FphA的功能中扮演着尤为关键的角色，可能参与红光信号的磷酸化传递和蛋白质相互作用。

讨论

本研究首次在黄曲霉中鉴定出红光受体FphA，并系统阐明了其在真菌生命活动中的多重功能。FphA的表达受红光诱导，这有利于放大红光效应。FphA通过调控brlA和abaA的表达，正向调控分生孢子的发育；在黑暗中，它通过上调nsdC和nsdD的表达促进菌核形成。更为重要的是，FphA通过抑制aflS的表达，负向调控致癌物AFB₁的合成。在致病性方面，FphA的缺失虽然降低了真菌在宿主上的生长和产孢能力（削弱了传播），但却意外地增加了毒素产量，使得受感染的作物仍然具有高风险。

研究还发现，红光本身能促进AF的生物合成，且这种促进作用不依赖于FphA的存在，暗示黄曲霉中可能存在其他红光受体。结构域分析表明，FphA的光感受模块（PAS、GAF、PHY）和信号输出模块（HK、RR）对其功能均不可或缺，尤其是C末端的RR结构域，对FphA的完整功能至关重要，这可能与其在信号转导中的作用有关。

结论

综上所述，FphA是黄曲霉中一个关键的红光传感器，它整合光信号，精细调控着真菌的分生孢子与菌核发育、黄曲霉毒素生物合成以及宿主侵染能力。其中，响应调节结构域（RR）是发挥其完整功能的核心。该研究不仅增进了对黄曲霉光信号转导机制的理解，也为开发通过调控光环境或靶向FphA及其信号通路来控制黄曲霉传播和毒素污染的新型策略提供了潜在靶点和理论依据。