甘蓝型油菜多分枝突变体mbm1的基因定位与候选基因鉴定：为高产品种培育提供新遗传资源

《International Journal of Molecular Sciences》：Genetic Mapping and Identification of Candidate Genes for a New Multi-Branching Mutant mbm1 in Brassica napus Shiqin Li, Bao Li, Zhengfeng Zhang, Nanwei Chen, Xinmei Li, Mei Li, Tonghua Wang and Xiaoying Zhao

本研究通过对EMS诱导的甘蓝型油菜多分枝突变体mbm1进行综合研究，发现其可显著提高有效分枝数、单株角果数和产量。遗传分析表明该性状受不完全显性核基因控制。通过结合批量分离群体测序（BSA-seq）和转录组测序（RNA-seq）分析，鉴定出两个候选基因BnaC03G0462000ZS (BnaC03.GAE6) 和 BnaC03G0491900ZS (BnaC03.MEE14)，KASP标记分析证实了这些基因位点与多分枝性状显著关联。将mbm1与商业品种杂交，其后代表现出因分枝数增加而显著提升的产量，为培育高产油菜品种和解析分枝遗传调控网络提供了重要资源与理论基础。

　　

甘蓝型油菜多分枝突变体mbm1的基因定位与候选基因鉴定

1. 引言

油菜（Brassica napus）是全球重要的油料作物。单位面积产量很大程度上取决于单株生产力，而单株角果数是其关键决定因素之一。在多数遗传背景下，分枝数是一个比单株角果数更稳定的性状，并能有效调节单株角果数，从而影响产量。研究表明，有效分枝数，尤其是主有效分枝数，与油菜产量呈显著正相关。优化不同种植密度下的主有效分枝结构和数量，可提高单株角果数并最终提升产量。

以往研究已鉴定出一些与油菜分枝相关的基因，例如Bna.AP1.A02、MAX1同源基因、Bna.TFL1、BnFAX6、BRC1基因家族以及SAME1基因等。然而，除了已知的TFL1、BRC1和SAME1通路外，是否还有其他基因参与油菜分枝数的调控仍有待进一步探索。本研究团队先前通过甲基磺酸乙酯（EMS）诱变，分离到一个多分枝突变体mbm1。本研究旨在对mbm1突变体进行农艺性状和遗传学的综合分析，并利用BSA-seq、RNA-seq和KASP标记鉴定其表型相关的候选基因，评估其在油菜育种中的应用潜力。

2. 结果

2.1. mbm1突变体表现出分枝数、总角果数和单株产量增加

与野生型（WT）相比，mbm1突变体在九叶期左右即可见腋芽和营养枝。在盛花期和成熟期，mbm1都产生了显著更多的分枝。成熟时，mbm1的主有效分枝数（17.8 ± 1.62）是WT（8.7 ± 1.42）的两倍多。其他农艺性状分析显示，mbm1的株高显著降低，开花略早，生育期稍短，角果长度也略短于WT。总角果数显著更高，约为WT的1.5倍。每角果粒数无显著差异，而千粒重低于WT。最终，mbm1的单株产量显著增加，约为WT的1.2倍。这些结果表明，mbm1突变体在分枝数和总角果数上显著增加，从而提高了单株产量。

2.2. mbm1突变体分枝数性状的遗传特征

为了研究mbm1突变体分枝数增加的遗传基础，在mbm1和WT之间进行了正反交，并评估了F₁代的分枝数。正反交F₁植株的分枝数无显著差异，但均显著高于WT亲本，又低于mbm1突变体，表现为中间表型。这表明mbm1的多分枝性状受不完全显性核基因控制，不受细胞质因子影响。

为了进一步验证该遗传模型，在mbm1与商业品种ZS11和L329之间进行了正反交。统计显示，ZS11与mbm1的正反交F₁植株的分枝数显著低于mbm1，尽管与ZS11存在统计显著差异，但其分枝数偏向于ZS11。L329与mbm1的正反交F₁代结果类似。这些结果进一步支持mbm1的多分枝性状表现为不完全显性并遵循核遗传。

为了确定mbm1的多分枝性状是数量性状还是质量性状，对ZS11×mbm1和L329×mbm1的F₂分离群体的分枝表型进行了统计分析。在两个群体中，分枝数均呈现连续分布，并有部分植株表现出超亲分离表型，且分枝性状均显著偏离正态分布。这种非正态分布表明该性状符合主基因+多基因遗传模型。这些结果证明mbm1突变体的多分枝性状是一个数量性状，并遵循核遗传模式。

1杂种和F₂代的分枝表型。(a–c) mbm1与WT(a)、ZS11(b)和L329(c)的正反交F₁杂种在成熟期的表型。(d–f) mbm1与WT(d)、ZS11(e)和L329(f)的正反交F₁杂种的分枝数。(g,h) 由mbm1与ZS11(g)和mbm1与L329(h)杂交衍生的F₂群体中分枝数的频率分布。">

2.3. 利用BSA-seq对mbm1多分枝性状进行基因定位

为了定位与mbm1多分枝性状相关的基因，利用L329×mbm1的F₂群体进行了BSA-seq分析。从F₂群体中，选取50株高分枝植株和50株低分枝植株，分别构成高分枝数混池（HB）和低分枝数混池（LB）。对HB、LB及亲本L329和mbm1进行测序。

使用欧氏距离（ED）方法进行目标性状的关联分析。结果显示，超过阈值的区间位于染色体C01、C03、C07和C08上，其中最高的ED值和最长的区间出现在染色体C03上。在C01、C03、C07和C08染色体上分别检测到显著关联区间。

接下来，使用Δ(SNP-index)方法进行了目标性状的关联分析。在染色体A10和C03上鉴定出两个显著关联的Δ(SNP-index)区间。位于C03染色体上的ΔSNP-index区间完全落在上述定义的ED-C03区域内，该区间被指定为ES-C03，位于C03染色体的35,524,886–36,127,337 bp，长度为602,451 bp。共筛选出11个SNPs。同时，从ES-C03之外的其他ED显著关联区间中，筛选出SNP-index差异显著的SNPs。最终，从所有目标性状关联区间中总共筛选出40个候选SNPs，用于进一步鉴定mbm1多分枝性状的候选基因。

4值，X轴表示每条染色体上的物理位置。(b) 基于Δ(SNP-index)在染色体上分布的定位区间。Y轴显示Δ(SNP-index)，X轴表示染色体上的物理位置。">

2.4. 利用RNA-seq鉴定mbm1和WT腋芽间的差异表达基因

为了进一步研究mbm1多分枝表型的遗传和分子机制，利用mbm1和WT植株的腋芽进行了RNA-seq分析。共鉴定出18,295个显著差异表达基因（DEGs），其中与WT相比，mbm1突变体中有9469个基因上调，8826个基因下调。

KEGG通路分析显示，DEGs主要与代谢过程相关，特别是与碳水化合物和糖代谢相关的通路。GO功能富集分析进一步强调了“对光刺激的反应”、“碳水化合物代谢过程”、“还原戊糖磷酸循环”、“枝条系统发育”、“次生枝形成”、“胚胎后植物形态发生”、“叶绿素结合”、“β-葡萄糖苷酶活性”和“多聚半乳糖醛酸酶活性”等术语的显著富集。KEGG和GO富集分析表明，碳水化合物和糖代谢途径的改变可能是mbm1多分枝性状的基础，为腋芽生长提供了潜在的机制基础。

糖是能源，已知其在许多物种中促进芽的生长。因此，研究重点关注了与糖代谢相关的差异表达基因。分析显示，编码关键蔗糖转运蛋白的五个SUC1和四个SUC2基因、编码蔗糖外排转运蛋白的四个SWEET12基因以及参与海藻糖-6-磷酸（Tre6P）代谢的一个TPPA基因的表达在mbm1中显著上调。研究表明，抑制蔗糖非发酵相关激酶（SnRK1）对于响应蔗糖可用性而激活生长组织中的生物合成途径至关重要。与此一致，编码SnRK1催化α亚基的KIN10和KIN11的表达在mbm1突变体中显著下调。此外，作为分枝关键负调控因子的五个BRC1基因的转录水平在mbm1突变体中也显著降低。qRT-PCR分析验证了这些结果。

为了确定糖相关基因的转录变化是否导致mbm1中糖水平改变，对腋芽中的蔗糖和海藻糖进行了定量。与野生型相比，mbm1中两种糖均显著升高。这些结果表明，腋芽中糖积累的增强可能有助于mbm1的多分枝表型。

2.5. 结合BSA-seq和RNA-seq数据关联分析以鉴定与mbm1突变体多分枝性状相关的候选基因

为了进一步鉴定与多分枝性状相关的候选基因，对通过BSA-seq鉴定的40个SNPs相关基因与RNA-seq数据中的DEGs进行了整合分析。在与40个SNPs相关的基因中，有13个在mbm1和野生型之间表现出显著表达差异。其中，两个位于ED-C03区间，一个在ES-C03区间，十个在ED-C07区间。随后分析了这13个候选基因在腋芽中的表达水平。四个基因表达水平极低，因此被排除。后续深入分析集中在剩余的九个候选基因上。

同源基因功能注释显示，其中七个基因是否参与分枝调控尚未见报道。BnaC03G0462000ZS拟南芥同源基因为UDP-D-葡萄糖醛酸4-差向异构酶6（GAE6），是果胶生物合成中的关键酶。果胶是初生细胞壁的基本成分，其丰度直接影响细胞壁的完整性和机械行为。BnaC03G0491900ZS拟南芥同源基因为母本效应胚胎停滞14（MEE14），在雌配子体中表达，为早期胚胎发育所必需。最近研究发现MEE14具有腺苷酸环化酶活性，能够产生cAMP，并参与胚胎发育和非生物胁迫响应。

基于其拟南芥同源基因的功能或表达模式，研究优先选择BnaC03.GAE6和BnaC03.MEE14进行进一步验证。为这两个基因中的候选SNPs开发了竞争性等位基因特异性PCR（KASP）标记。利用KASP-BnaC03.GAE6标记对273株L329与mbm1杂交的F₂植株进行基因分型，结果显示不同基因型间的分枝数存在显著差异。类似地，利用KASP-BnaC03.MEE14标记对317株F₂植株进行基因分型，也显示出分枝数的显著变异。这些结果表明这些位点与目标性状显著关联且共分离。

BnaC03.GAE6中的SNP是位于转录起始位点上游2907 bp处的G-to-A突变，而BnaC03.MEE14中的SNP是位于转录终止位点下游1327 bp处的C-to-T突变。RNA-seq分析显示，与野生型相比，这两个基因在mbm1腋芽中均上调，qRT-PCR证实了这一点。综上所述，这些结果表明BnaC03.MEE14和BnaC03.GAE6是mbm1突变体多分枝表型的候选基因。

2群体中KASP标记KASP-BnC03.GAE6和KASP-BnC03.MEE14的基因分型。(a) L329 × mbm1的F₂群体中KASP-BnC03.GAE6标记基因分型的散点图。(b) L329 × mbm1的F₂群体中KASP-BnC03.GAE6标记的基因分型及相应的分枝数。(c) L329 × mbm1的F₂群体中KASP-BnC03.MEE14标记基因分型的散点图。(d) L329 × mbm1的F₂群体中KASP-BnC03.MEE14标记的基因分型及相应的分枝数。">

2.6. 多分枝突变体mbm1在育种中的潜在应用

mbm1突变体表现出优异的农艺性能，包括分枝数增加、总角果数更高和单株产量提高。为了评估其育种潜力，对mbm1与品种ZS11和L329杂交产生的F₁代的农艺性状进行了统计分析。

在总角果数方面，F₁代虽低于mbm1，但显著高于ZS11和L329。在每角果粒数方面，ZS11 × mbm1的F₁代与ZS11相当且优于mbm1，而L329 × mbm1的F₁代显著优于优良亲本，表现出明显的杂种优势。在千粒重方面，ZS11 × mbm1和L329 × mbm1的F₁代均超过双亲，呈现正向改良趋势。在单株产量方面，F₁代的产量显著高于商业亲本。这些结果表明，mbm1可以将其高产性状稳定遗传给杂种，使F₁代达到与高产亲本相当的产量水平，同时显著改善低产亲本的表现。这凸显了mbm1在育种应用中的广阔潜力。

此外，农艺性状分析结果显示，在mbm1与ZS11或L329的正反交中，包括分枝数、总角果数、每角果粒数、千粒重和单株产量在内的关键产量相关性状均无显著差异。这些发现表明，在以利用这些特定组合改良株型为目标的杂种优势育种中，亲本选择可能无需考虑正反交效应。这为利用与株型相关的杂种优势提供了更大的灵活性。

3. 讨论

分枝数是油菜单株角果数和最终产量的直接决定因素。先前研究表明，主有效分枝数对产量的贡献最大，改变分枝结构可以显著增加单株角果数。本研究进一步证实了分枝数通过增加单株有效角果数间接促进产量，特别是在常规种植密度下。mbm1突变体的分枝数是WT的2.04倍，单株总角果数增加约50%，单株产量提高25%。此外，在mbm1与WT或商业品种ZS11和L329的正反交F₁杂种中，未观察到分枝性状的显著差异，表明分枝性状的遗传不受细胞质效应影响。这简化了亲本选择，有利于该株型性状在杂交育种体系中的高效利用。

BSA-seq通过混合极端表型个体进行测序，避免了逐个基因分型，为定位复杂性状提供了高效的基因定位方法。本研究整合BSA-seq与RNA-seq对多分枝突变体mbm1进行定位。利用HB和LB及全基因组测序数据，检测到几个与多分枝表型显著相关的区间，其中最突出的位于C03染色体上。从这些区域筛选出40个候选SNPs。将这些SNPs所在的候选基因与RNA-seq数据中的DEGs进行交叉比对，整合分析得到9个在腋芽中高表达且在mbm1与WT间表达差异显著的候选基因。基于拟南芥同源基因的功能注释和通过KASP标记进行的基因型-表型关联分析，初步确定C03染色体候选区间内的两个基因——BnaC03.GAE6和BnaC03.MEE14——为与mbm1多分枝性状相关的候选基因。

RNA-seq和qRT-PCR分析显示BnaC03GAE6和BnaC03MEE14在mbm1突变体中的表达显著上调。一个关键问题是这些基因中的SNPs如何影响其表达。分析表明，BnaC03GAE6转录起始位点上游2907 bp处的G-to-A突变位于一个AP2家族转录因子结合位点内，该突变可能干扰转录因子结合从而影响BnaC03GAE6表达。而BnaC03MEE14转录终止位点下游1327 bp处的C-to-T突变位点未鉴定出转录因子结合位点。基于近期研究，推测BnaC03MEE14的下游突变可能通过改变局部染色质结构或产生新的调控元件来影响其表达。

另一个关键问题是BnaC03.GAE6和BnaC03.MEE14如何调控分枝。BnaC03.GAE6的拟南芥同源基因GAE6编码UDP-半乳糖醛酸生物合成的关键酶，UDP-半乳糖醛酸是果胶的主要前体。改变GAE6的表达可调节果胶含量，从而影响细胞壁的机械性能和通透性。鉴于细胞壁通透性是细胞间糖运输的关键决定因素，而糖既是必需能源又是促进芽生长的信号，推测BnaC03.GAE6表达的变化可能通过改变芽中糖水平来影响分枝。与此假设一致，在mbm1突变体腋芽中观察到BnaC03.GAE6的显著上调以及蔗糖和海藻糖水平的显著升高。基于这些相关证据及其同源基因明确的功能，提出BnaC03.GAE6通过调节果胶生物合成，进而预测可重塑细胞壁并随后影响芽中细胞间糖转运和积累，从而促进mbm1分枝表型。

BnaC03.MEE14是拟南芥MEE14的同源基因，MEE14是雌配子体和早期胚胎发育所必需的基因。近期研究表明MEE14具有腺苷酸环化酶活性，可产生cAMP，并在能量代谢和胁迫响应中发挥作用。本研究发现BnaC03.MEE14在mbm1突变体腋芽中上调。基于这些发现，推测BnaC03.MEE14可能通过调节能量代谢和糖积累来改变mbm1的分枝，尽管需要进一步实验来确定直接的因果关系。

糖部分通过下调BRC1表达来促进芽生长。BRC1是腋芽生长的关键抑制因子。海藻糖-6-磷酸（Tre6P）是一种磷酸化二糖，作为蔗糖可用性的细胞内信号，整合代谢状态与生长和发育程序。在腋芽中异源表达海藻糖-6-磷酸磷酸酶（TPP）可降低Tre6P水平并抑制分枝。升高的Tre6P水平下调BRC1表达，从而促进分枝。此外，蔗糖非发酵相关激酶1（SnRK1）也参与BRC1的转录调控。已知Tre6P抑制SnRK1活性。Tre6P介导的SnRK1抑制是响应蔗糖可用性而激活生长组织中生物合成过程所必需的。本研究发现，蔗糖代谢相关基因，包括SUC1、SUC2和SWEET12，在mbm1突变体腋芽中上调。与此一致，腋芽中蔗糖和海藻糖水平升高。正如预期，与野生型相比，KIN10、KIN11和BRC1在mbm1突变体芽中的表达降低。因此得出结论，蔗糖积累的增加可能至少部分导致了mbm1突变体的多分