《International Journal of Molecular Sciences》：Longitudinal Whole-Exome Sequencing Identifies Clonal Hematopoiesis and Genomic Heterogeneity as a Predictor of Treatment Outcome in Patients with Newly Diagnosed, Elderly Chronic Lymphocytic Leukemia
Ho Cheol Jang,
Ga-Young Song,
Hyeonjin Jeong,
Ja Min Byun,
Jee Hyun Kong,
Myung-won Lee,
Won Sik Lee,
Ji Hyun Lee,
Ho Sup Lee and
Deok-Hwan Yang
+ 1 author
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该研究通过在韩国老年初诊CLL患者队列中进行纵向全外显子组测序（WES），发现基线突变谱异质性（通过主成分分析/PCA评估）和治疗后CHIP（克隆造血未明潜质）状态动态变化，可为传统的治疗结束（EOT）疗效评估提供补充信息，提示基因组模式可能有助于风险分层和预后预测。
1. 引言
慢性淋巴细胞白血病（CLL）在西方人群中最常见，但在亚洲国家发病率显著较低。尽管如此，其临床病程同样具有异质性。在韩国，CLL的罕见性限制了拥有纵向生物样本和全面基因组分析的队列的可用性。CLL的治疗格局已迅速扩展，然而，超越早期疗效评估、能够预测长期结局的生物标志物仍具有临床价值。全外显子组测序（WES）提供了体细胞变异的全面视图。包括主成分分析（PCA）在内的降维方法使得可视化患者间相似性和差异性成为可能。在纵向背景下，将治疗前和治疗后的突变谱投射到共享空间中，可以进行患者内部的轨迹分析。克隆造血未明潜质（CHIP）为基因组解释增添了另一个维度，其本身可能与治疗耐受性、竞争风险和不良结局相关。然而，联合评估CHIP状态及其随时间变化以及跨治疗时间点的突变谱异质性的纵向研究仍然有限，尤其是在亚洲CLL队列中。
2. 结果
2.1. 临床特征与治疗
基线人口统计学和临床特征，包括常规核型和细胞遗传学发现，总结于表1。游泳图（图1）总结了所有33名入组患者的治疗暴露和随访情况。大多数患者完成了计划的六个周期氯氨酯-奥比妥珠单抗治疗，并接受了治疗结束（EOT）的疗效评估。在治疗完成者（n = 25）与未完成者（n = 8）之间，诊断时的基线突变负荷无显著差异。
2.2. 基线WES突变谱异质性与临床状态注释
诊断时基线WES突变谱通过主成分分析（PCA）总结，显示出患者间的异质性（图2）。当基线样本在PCA空间可视化并用EOT疗效注释时（图2A），达到完全缓解（CR）的患者似乎聚集得更紧密，而部分缓解（PR）或疾病进展（PD）的患者在PCA空间中更为分散。当用最后一次门诊随访时的疾病状态（图2B）注释相同的基线突变谱时，也观察到类似的模式。在EOT后约3-5个月获得的治疗后WES谱（POST）（图2C）也显示出异质性结构。
2.3. 治疗期间突变谱变化的PRE-to-POST轨迹分析
将成对的PRE-和POST-WES突变谱投射到共享的PCA空间并连接，以可视化患者特异性轨迹（图3）。在整个队列中，轨迹在方向和幅度上各不相同（图3A）。当按EOT疗效分层时，达到CR的患者倾向于显示出从PRE到POST相对均质、紧凑的移动（图3B）。相比之下，PR病例在PCA空间中显示出更分散的移动模式（图3C）。PD病例则表现出高度异质性的轨迹，在不同患者间没有一致的主导方向（图3D）。
2.4. 基线聚类与克隆造血相关突变的富集
为了形式化基线突变谱异质性，将治疗前WES突变谱总结为二元患者-基因突变矩阵，并在PCA空间中使用k均值（k = 2）进行聚类，识别出一个分散的簇（簇1；n = 9）和一个紧凑的簇（簇2；n = 24）（图4A）。CHIP相关突变在簇1中比在簇2中更常见（5/9 [55.6%] vs. 2/24 [8.3%]；Fisher精确检验 p = 0.0086）。簇1中每位患者的CHIP突变负荷也较高（图4B）。
2.5. 克隆造血状态的纵向转变与疾病过程
图5整合了诊断时（PRE）、治疗结束时（EOT）疗效、EOT后3-5个月（POST）以及最后一次门诊随访（Last Status）时的疾病状态下的CHIP状态。诊断时，7名患者为CHIP阳性（CHIP+），26名患者为CHIP阴性（CHIP-）。在拥有配对PRE和POST测序的患者中，CHIP状态随时间发生变化，包括基线CHIP阳性的消失以及治疗后CHIP阳性的出现。
3. 讨论
在这个接受氯氨酯-奥比妥珠单抗治疗的初诊CLL纵向队列中，我们使用系列WES来表征基线突变谱异质性和CHIP在诊断、治疗、早期治疗后评估和长期门诊随访期间的变化。从治疗时间线得出的一个关键临床观察是，虽然EOT的疗效评估具有临床意义，但并未完全反映所有患者的长期疾病状态。结合基线PCA结果来看，这些不一致的病程更常出现在基线突变谱在PCA空间中更分散的患者中。在我们的队列中，诊断时的基线突变负荷在完成治疗和未完成治疗的患者之间没有差异。
轨迹分析通过将成对的PRE和POST样本投射到共享PCA空间，扩展了WES在静态基线分析之外的应用。在此框架内，我们观察到患者内部移动的幅度和方向上存在与疗效相关的差异。CHIP提供了另一个概念上不同的维度。在我们的队列中，CHIP相关突变在分散的基线簇患者中富集，并伴有更高的每位患者CHIP突变负荷。另一方面，CHIP在个体层面并非决定性因素。
从临床实施的角度来看，WES在许多情况下并不常规用于CLL，尤其是在治疗完成后。尽管如此，我们的纵向数据为在选定的患者中考虑治疗后基因组重新评估提供了依据。我们还观察到，CHIP状态并非一成不变。虽然这些转变的临床意义在这个规模不大的队列中无法最终确定，但这一观察结果支持了以下假设：治疗后取样可能揭示仅从EOT疗效无法看出的宿主克隆结构演变。
CHIP在周围血和骨髓中的动态性质引发了仅靠肿瘤WES无法解决的机制性问题。CHIP相关变异的明显消失或出现可能反映了与治疗相关的选择、克隆竞争、样本细胞组成的差异、采样变异性或区室特异性生物学。未来的研究整合正交验证和改进的克隆分辨率，包括匹配的种系测序、细胞分选或CD19富集，以及更深的靶向测序，对于区分恶性CLL来源的变异与CHIP来源的变异以及量化低于标准WES灵敏度阈值的较小克隆至关重要。
需要承认几个局限性。队列规模不大，样本在不同时间点的可用性不同，这可能会引入选择和生存偏倚。来自混合细胞样本的仅肿瘤WES限制了克隆归属，并且CHIP基因列表与CLL中可能发生改变的基因有重叠，这可能使解释复杂化。此外，基于PCA和k均值的总结可能对特征选择和缺失数据敏感，目前的发现应被视为假设生成而非确认性。最后，因为我们没有纳入使用完全统一流程分析的外部西方队列，所以无法进行正式的跨人群比较，因此无法确定此处观察到的基因组模式是否具有人群特异性。在临床转化之前，需要在更大规模的队列中以及在现代治疗方案（包括BTK抑制剂或venetoclax为基础的治疗）下进行前瞻性验证。
4. 材料与方法
4.1. 研究设计与患者
这项多中心、前瞻性、纵向研究纳入了33名接受氯氨酯-奥比妥珠单抗治疗的初诊、老年CLL患者。在诊断（PRE）和治疗结束（EOT）后约3至5个月（POST）采集周围血或骨髓穿刺液。临床信息从病历中提取。疗效和疾病状态在EOT和最后一次门诊随访时被分类为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、疾病进展（PD）或无法评估（NE）。
4.2. 样本采集、全外显子组测序与初级处理
使用Chemagic磁性分离模块I方法和DNA Blood 20 μL试剂盒从EDTA全血或骨髓穿刺液中提取基因组DNA。使用MGIEasy外显子组捕获V5制备文库，并在MGI DNBSEQ-G400平台上测序。全外显子组测序读段通过BWA-MEM比对到GRCh38/hg38参考基因组。体细胞变异调用以仅肿瘤模式进行，并限于外显子组目标区域。从过滤后的VCF中，保留通过所有Mutect2过滤器的变异。提取变异水平的测序深度（DP）和等位基因深度（AD），并计算变异等位基因分数（VAF）。这些源自VCF的DP和VAF指标用于下游过滤和可视化。
4.3. 基因水平突变谱分析、PCA与基线聚类
如果一个基因中至少存在一个合格变异，则该基因被视为在该样本中突变。在诊断（PRE）时构建了一个二元患者-基因矩阵，并将少于两个患者中观察到的基因从PCA特征空间中排除。在居中和缩放的二元矩阵上进行PCA，在PCA空间中进行无监督k均值聚类。通过将PRE和POST样本组合成统一的患者-时间点矩阵来评估突变谱的时间变化。
4.4. 克隆造血定义与统计学检验
CHIP状态在样本水平上通过在一组预先指定的CHIP基因（包括DNMT3A、TET2、ASXL1、PPM1D、TP53、JAK2、剪接体基因及相关经典CHIP基因）中存在≥1个合格突变来定义。使用Fisher精确检验和Wilcoxon秩和检验比较簇间和跨时间点的CHIP患病率以及每位患者的CHIP突变负荷。
4.5. 临床结局与疾病状态转变
游泳图总结了从入组开始的随访持续时间。通过标准化的治疗周期索引对实验室趋势进行纵向可视化。为了总结研究时间线上分类状态的转变，桑基图整合了诊断时CHIP状态、治疗反应和最后一次随访时的疾病状态。
4.6. 软件与统计
初级处理使用BWA-MEM、SAMtools、Picard和GATK。变异注释使用ANNOVAR。统计分析和图形生成在R中完成。
5. 结论
在这个接受氯氨酯-奥比妥珠单抗治疗的初诊老年慢性淋巴细胞白血病纵向队列中，系列全外显子组测序能够表征诊断时患者间的基因组异质性，并且存在跨时间点的CHIP相关变异的动态变化。基线突变负荷未能解释早期治疗中断，而对突变景观的无监督、模式水平的总结捕获了与疗效类别和长期随访状态相一致的异质性。CHIP相关变异在分散的基线突变模式中富集，这凸显了在解释老年患者的系列血液或骨髓测序时考虑宿主克隆造血的重要性。尽管这些发现是探索性的，并受到样本量有限的限制，但它们支持进一步评估纵向全外显子组测序作为传统疗效评估的补充方法，用于慢性淋巴细胞白血病的风险富集和治疗后监测。需要更大规模、更长期随访的研究来验证其临床效用并阐明所观察到的突变模式的生物学基础。
