偏振相敏荧光图像相关光谱：一种解析异质系统中分子密度、亮度、寿命与旋转相关时间的新方法

《Biomolecules》：Polarized Phase-Sensitive Fluorescence-Image Correlation Spectroscopy Andrew H. A. Clayton

本文介绍了一种将荧光寿命成像显微镜(FLIM)、图像相关光谱(ICS)与偏振检测相结合的创新技术——偏振相敏荧光图像相关光谱(polarized phase-sensitive fluorescence-image correlation spectroscopy)。该方法通过分析不同探测器相位下的簇密度变化，可同时获取异质样本(如细胞膜域或不同寡聚态蛋白质)中多个物种的簇密度、相对亮度、荧光寿命及旋转相关时间。研究以两态模型为例，在模拟和亮珠实验体系中验证了该技术的可行性，为在复杂生物环境中定量表征分子相互作用与动态提供了有力工具。

　　

1. 引言

分子相互作用是生命细胞功能的核心。分子以不同的四级结构形式存在，在信号级联中与伙伴结合，形成瞬时的五元相互作用，定位于膜结构域，并在无膜凝聚物中聚集。测量这些分子组装体的浓度、大小和动力学，特别是在异质性为常态的细胞内，是一项持久的生物物理挑战。来自荧光寿命、荧光涨落和荧光偏振的正交信号分别提供了探测相互作用与环境、浓度与大小以及旋转动力学的重要指标。

荧光本身是一个富含信息的现象。处于激发态的平均时间，即荧光寿命(通常为纳秒级)，对分子环境敏感。荧光偏振(或各向异性)是荧光中对旋转运动敏感的一个维度。在宽场频域荧光寿命成像显微镜(FLIM)中，荧光被与荧光同频调制的二维增强相机探测。通过将检测器相位相对于荧光逐步移动，具有特定寿命的粒子可以与检测器同相或反相，从而实现光学抑制或增强。当在寿命测量中加入偏振激发和正交偏振检测时，慢速旋转物种的荧光相对于快速旋转物种会被选择性减弱，而旋转与激发态寿命相当的物种相位会进一步延迟。通过比较非偏振情况与偏振情况下的相位依赖性簇密度，原则上可以提取不同物种的旋转相关时间信息。

2. 材料与方法

偏振和相位依赖性图像使用安装在研究级显微镜上的商业频域FLIM系统收集。激发由474 nm LED(调制频率35 MHz)提供，通过线性偏振器，经4倍物镜聚焦。荧光通过高光谱成像系统观察，并由增强型CCD相机成像。图像增强器的光阴极在与激发相同的频率(35 MHz)下被调制。在计算机控制下，以伪随机顺序记录12个相位图像，每相位图像曝光时间为500毫秒。

12幅相位依赖性图像的堆栈被导入FIJI进行空间自相关分析。使用FD Math中的相关选项进行自相关分析，通过归一化像素数和平均图像强度的平方，并最终减去1进行校正。零滞后自相关的倒数被计算为簇密度(单位：每束面积的数量)。

3. 理论

在实验荧光寿命成像显微镜设置中，物体中的荧光团受到强度调制激发(正弦)，荧光被图像增强器-相机组合探测，其灵敏度也在与激发相同的频率下调制。在这种零差工作模式下，荧光图像在检测器的不同相位设置下记录。如果我们将平均图像强度I绘制为检测器相位?的函数，强度分布遵循类余弦函数。

在相位敏感染光图像相关光谱技术中，图像相关光谱分析应用于作为相位函数记录的荧光图像。在传统ICS中，强度涨落空间自相关函数使用二维快速傅里叶变换算法从图像I(x,y)计算。零滞后自相关函数g₁₁(0,0)提供了每束面积平均粒子数的倒数测量值，通过将空间自相关函数拟合到二维高斯函数获得。其中g_∞是用于解释长程空间相关的偏移，ω是空间自相关函数的半高全宽。

使用簇密度(N)和平均亮度(B)作为图像中粒子分布的更直观度量是方便的。簇密度可以从自相关函数的振幅和宽度容易地获得，即N = (g(0) π ω²)^-1。

4. 结果与讨论

为测试这种新的ICS变体提供了一个测试平台，将两态模型作为异质系统的最简单情况。模拟了不同寿命和相关时间的组合，允许一个群体比另一个群体更亮。然后，测量了由亮珠组成的模型荧光系统的非偏振激发和偏振激发的相敏图像。在两态模型的背景下，能够恢复两种状态的簇密度、相对亮度、寿命和旋转相关时间。

5. 结论

偏振相敏荧光图像相关光谱方法成功地将荧光寿命成像、图像相关光谱和偏振检测相结合。该技术能够从图像中同时确定不同物种的密度、亮度、寿命和旋转相关时间。通过在两态模型系统中验证，该方法证明了其在解析如膜域中的受体系统或不同寡聚态蛋白质等异质生物系统方面的潜力。新的方法为在复杂的细胞环境中定量表征分子组装和动力学提供了一个有力的工具，有望增进对分子相互作用和旋转运动的理解。