SR8278在人角质形成细胞中独立于REV-ERB核受体蛋白抑制细胞增殖

《Biomolecules》：The Small Molecule SR8278 Inhibits Cell Proliferation Independent of the REV-ERB Nuclear Receptor Proteins in Human Keratinocytes Ushaswini Atluri, William Cvammen and Michael G. Kemp

这篇研究性论文揭示了一个重要发现：小分子化合物SR8278（一种已知的REV-ERB拮抗剂）在抑制人角质形成细胞（keratinocyte）增殖时，其作用并不依赖于其传统靶点——调控代谢和昼夜节律的REV-ERB（reverse c-ERBAα）核受体蛋白。作者通过RNA-seq、CRISPR/Cas9基因编辑等多种分子生物学手段证明，SR8278能通过抑制细胞周期G1/S转换相关基因（如E2F1、RRM2、CCNE2、PCNA）的表达，显著减缓包括角质形成细胞和癌细胞在内的多种细胞系生长，且此效应不诱导基因毒性应激或凋亡。文章强调了在研究SR8278等化合物时，必须辅以基因学手段验证其作用机制，以防止对结果的错误解读。

　　

引言

REV-ERBα (由NR1D1编码) 和 REV-ERBβ (由NR1D2编码) 是核受体蛋白，以血红素为天然配体，在代谢和昼夜节律调控中扮演核心角色。传统上它们作为转录抑制因子发挥作用，但新近研究表明REV-ERBα在某些癌细胞中可转变为转录激活因子。针对REV-ERB的药理学调控，包括拮抗剂SR8278和激动剂SR9009，已被报道在多种疾病模型中显示出益处，例如促进角膜修复、减少肌肉纤维化、减缓肿瘤生长等。然而，SR8278对角质形成细胞的基因表达和增殖的影响及其对REV-ERB的依赖性此前尚不明确。

材料与方法

研究使用了多种细胞系，包括人角质形成细胞系HaCaT、端粒酶永生化人二倍体角质形成细胞N-TERT，以及HeLa、U2OS、A549癌细胞系。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了REV-ERBα、REV-ERBβ单敲除及双敲除（DKO）的HaCaT细胞株，也利用siRNA在N-TERT细胞中进行了REV-ERB的瞬时敲低。使用MTT法、结晶紫染色、流式细胞术检测细胞增殖和周期分布。通过RNA-seq、RT-qPCR和Western blotting分析基因和蛋白表达变化。

结果

1. 1.
   SR8278影响细胞增殖相关基因的表达
   利用RNA-seq分析发现，SR8278处理显著改变了2686个基因的表达。基因本体富集分析显示，受影响最显著的生物学过程包括胆固醇生物合成的调节和有丝分裂细胞周期的G₁/S转换。通过RT-qPCR和Western blotting证实，SR8278显著下调了多个参与G₁/S转换和增殖的关键基因，如转录因子E2F1、核苷酸还原酶亚基M2（RRM2）、细胞周期蛋白E2（Cyclin E2）和增殖细胞核抗原（PCNA）的mRNA和蛋白水平。这种下调呈现剂量依赖性，低至5 μM的SR8278即可显著降低RRM2蛋白水平。
2. 2.
   SR8278减缓多种细胞系的增殖
   细胞增殖实验（结晶紫染色、MTT法）表明，SR8278能显著抑制HaCaT、N-TERT、A549、U2OS和HeLa细胞的生长，并在HaCaT细胞中导致G₁期细胞比例增加，S期和G₂/M期细胞比例减少。然而，这种增殖减缓并未伴随DNA损伤检查点信号（如CHK1、KAP1、H2AX的磷酸化）的激活，也未诱导细胞凋亡（未检测到PARP剪切）。
3. 3.
   SR8278减缓细胞增殖不依赖于REV-ERB蛋白
   这是本研究的核心发现。尽管SR8278被报道为REV-ERB拮抗剂，但基因层面的证据表明其抗增殖效应是独立于REV-ERB的：
   • •
     通过CRISPR/Cas9成功构建了REV-ERBα、β单敲除和双敲除的HaCaT细胞系，并验证了其功能缺失（如REV-ERB靶基因BMAL1表达上调）。
   • •
     在野生型、单敲除和双敲除的HaCaT细胞中，SR8278对细胞增殖的抑制程度相似，且均能同等程度地下调E2F1和RRM2蛋白的表达。
   • •
     在N-TERT细胞中，利用siRNA有效敲低REV-ERBα和β的表达后，SR8278依然能够以剂量依赖的方式抑制细胞增殖，并下调RRM2蛋白水平，其效果与对照siRNA处理的细胞无异。

讨论

本研究证实SR8278能在多种细胞类型中减缓细胞增殖，这一发现与近期报道的SR8278在体内减缓肿瘤生长的研究相一致。然而，基因敲除或敲低REV-ERB蛋白并不影响角质形成细胞的生长速率，也不改变SR8278的抗增殖效应，这强有力地表明SR8278的该效应并非通过抑制REV-ERB介导。这一结果与之前一些将SR8278的生物学效应直接归因于REV-ERB抑制的研究形成了对比。研究指出，REV-ERB激动剂SR9009也被报道存在不依赖于REV-ERB的增殖抑制效应，因此，对于SR8278和SR9009这类化合物，尤其是在研究细胞增殖相关表型时，需要谨慎解读药理实验结果，并强烈建议辅以基因敲除/敲低等互补性遗传学手段来验证其作用机制。SR8278不依赖于REV-ERB抑制细胞增殖的具体分子靶点仍有待进一步研究。

结论

基于本研究数据，在解读使用SR8278进行的细胞增殖实验时，若缺乏互补的基因敲低或敲除验证，需格外谨慎，因为该化合物可能存在不依赖于REV-ERB的脱靶效应。