DNA聚合酶β（Polβ）低表达不影响中脑整体DNA甲基化水平：PolβL301R-V303R敲入小鼠的表型与机制研究

《Biomolecules》：Hypomorphic Protein Expression of DNA Polymerase Beta in PolβL301R-V303R/L301R-V303R Knock-In Transgenic Mice Does Not Impact Global DNA Methylation Levels in the Midbrain Bryce Jacobs, Dan Ivanov, Ivana Barraza, Christopher Faulk, Carmen J. Booth, Raquel Mattos-Canedo, Lucas Tian, Kaitlyn DePietro, Alper Uzun and Robert W. Sobol + 2 authors

本研究深入探索了DNA修复关键酶Polβ与支架蛋白XRCC1相互作用缺失对小鼠全身Polβ蛋白稳定性及基因甲基化模式的影响。通过构建并系统表征PolβL301R-V303R/L301R-V303R纯合敲入（KI）小鼠模型，发现尽管多个组织Polβ蛋白水平显著降低，但mRNA表达正常，且小鼠在无外部应激条件下，中脑整体DNA甲基化（5mC/5hmC）水平未受显著影响。该模型为研究Polβ在基因稳定、主动去甲基化（BER途径）及与神经退行性疾病等关联中的作用提供了宝贵工具。

　　

文章内容归纳总结

1. 引言

DNA聚合酶β（Polβ）是一个39 kDa的单多肽酶，兼具缺口修剪和核苷酸转移酶活性，是碱基切除修复（BER）途径和主动基因去甲基化最后步骤中的关键聚合酶。先前研究表明，小鼠Polβ蛋白中的L301和V303残基对其与BER支架蛋白X射线修复交叉互补蛋白1（XRCC1）的相互作用至关重要，突变这些残基会损害Polβ与XRCC1的结合，从而对BER复合物的组装产生负面影响。为了探索这一关键蛋白质复合物缺陷如何影响小鼠的基因组稳定性，研究人员开发了Polβ^{L301R-V303R/L301R-V303R}敲入小鼠。本研究的目的是全面表征该小鼠模型，检测其在不同组织中的Polβ蛋白和mRNA水平，探究Polβ蛋白水平降低的潜在机制，并通过纳米孔测序评估肝脏和大脑基因组DNA中5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的水平，以研究被抑制的Polβ蛋白水平对主动基因去甲基化的影响。

2. 材料与方法

本研究使用了三组小鼠队列。小鼠队列#1 包括24只6-9月龄的小鼠（8只野生型WT，8只杂合型HET，8只纯合型HOM），用于分离肝脏和大脑进行蛋白质、mRNA分析以及全基因组浅层测序。小鼠队列#2 包括4只WT和8只HOM小鼠（10-15周龄），用于全面表型分析，包括组织病理学检查和全血细胞计数，并检测了心脏、脾脏和肾脏的Polβ蛋白水平。小鼠队列#3 包括12只20-24月龄的小鼠（6只WT，6只HOM），用于大脑不同区域（小脑、中脑、纹状体、皮层）的显微解剖和蛋白质分析。

实验方法主要包括：从组织样本中同步分离DNA、RNA和蛋白质；通过免疫印迹法（Immunoblot）定量分析Polβ蛋白水平，以组蛋白H3作为上样对照；通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析Polβ和Xrcc1的mRNA表达水平；对WT和HOM小鼠耳源性成纤维细胞进行蛋白质稳定性实验，使用蛋白质合成抑制剂放线菌酮（cycloheximide）和蛋白酶体抑制剂MG132处理；通过纳米孔测序进行全基因组浅层测序，以评估5mC和5hmC的全局水平。

3. 结果

3.1. Polβ蛋白水平在多种Polβ^{L301R-V303R/L301R-V303R}小鼠组织中降低

免疫印迹分析显示，与WT同窝小鼠相比，HOM小鼠肝脏中的Polβ蛋白水平显著降低至26.8%，HET小鼠降至72.2%。然而，qRT-PCR分析表明，WT、HET和HOM小鼠肝脏中的Polβ或XRCC1 mRNA表达水平没有显著差异。同样，在大脑组织中，HOM小鼠的Polβ蛋白水平降至WT的23.4%，HET降至80.8%，而mRNA水平同样无显著变化。对心脏、脾脏和肾脏的分析进一步证实了Polβ蛋白水平的普遍降低，在HOM小鼠中分别降至WT的18.7%、41.8%和27.9%。

3.2. 不同脑区的Polβ蛋白水平

对老年小鼠（20-24月龄）四个脑区（小脑、中脑、纹状体、皮层）的显微解剖分析显示，HOM小鼠所有被检测脑区的Polβ蛋白水平均显著低于WT小鼠。其中，中脑的下降最为显著，Polβ蛋白水平仅为WT的11.0%，而小脑、纹状体和皮层分别为17.4%、17.0%和20.0%。

3.3. Polβ在L301R/V303R HOM小鼠耳成纤维细胞中的稳定性

鉴于mRNA水平未变，研究人员探究了Polβ蛋白不稳定性是否导致其水平降低。用放线菌酮处理HOM小鼠耳成纤维细胞6小时后，Polβ蛋白水平进一步降低（降至未处理HOM细胞的58.4%）。用蛋白酶体抑制剂MG132或MG132联合放线菌酮处理，可使Polβ水平部分恢复（相较于仅用放线菌酮处理的细胞，分别增加70.7%和46.1%）。这表明突变Polβ蛋白的不稳定性至少部分是由蛋白酶体介导的降解导致的。

L301R-V303R小鼠耳成纤维细胞中Polβ的稳定性。">

3.4. 基因组浅层测序揭示组织特异性甲基化水平

纳米孔测序分析显示，小鼠肝脏的全局5mC水平（约72%）显著高于大脑（约68%），而5hmC水平则呈现相反趋势，大脑（约10%）显著高于肝脏（约5%）。然而，无论是比较肝脏和大脑（队列#1），还是专门分析中脑（队列#3），在WT和HOM小鼠之间，均未检测到5mC或5hmC水平的显著差异。

4. 讨论与结论

本研究表明，Polβ^{L301R-V303R/L301R-V303R}HOM敲入小鼠在多种组织中具有显著降低的Polβ蛋白水平，但其mRNA表达不受影响，这指向了蛋白质稳定性的下降。实验结果支持了之前的假设，即Polβ与XRCC1相互作用的受损导致蛋白质不稳定，并至少部分通过蛋白酶体途径被降解。尽管Polβ在主动基因去甲基化（BER途径）中扮演角色，但在无外部应激条件下，Polβ蛋白水平的严重降低并未导致中脑整体DNA甲基化模式的显著改变。这一发现提示，在基础状态下，低水平的Polβ可能足以维持正常的甲基化稳态。

综上所述，Polβ^{L301R-V303R/L301R-V303R}小鼠模型是一个有价值的“低表达”模型，其显著特征是Polβ蛋白稳定性降低而非基因表达抑制。该模型为未来研究Polβ在应对环境基因毒素、饮食压力、衰老或神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）背景下的功能，特别是在基因组稳定性和表观遗传调控中的作用，提供了新的工具。未来的研究可以在此基础上，探索在特定应激条件下，Polβ低表达是否会导致更精细的甲基化模式改变或DNA修复缺陷。