《Biomolecules》：Investigating the Effect and Mechanism of Protocatechuic Aldehyde on Vascular Dementia Based on Multi-Omics Approach
Tian Xiao,
Jie Tao,
Jiaoyang Tan,
Xingjie Yi,
Ziyi Wang and
Xiaohua Duan
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本研究采用2VO（two-vessel occlusion）大鼠模型及OGD（oxygen-glucose deprivation）损伤的星形胶质细胞-神经元共培养体系，结合血浆与脑组织代谢组学及转录组学分析，系统揭示了中药单体原儿茶醛（protocatechuic aldehyde, PAL）治疗血管性痴呆（vascular dementia, VaD）的作用与机制。研究发现PAL可显著改善认知功能障碍，其机制核心在于下调囊泡谷氨酸转运体1（vGLUT1）表达以减少谷氨酸（glutamate）释放，促进谷氨酸向谷氨酰胺（glutamine）转化，同时上调糖酵解关键酶（GLUT-1、HK2、PFK、LDHA/B、PDH）及单羧酸转运蛋白（MCT1/2/4）表达，从而增强星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭（lactate shuttle），优化细胞间能量供应。该研究为PAL的临床开发提供了机制依据和临床前证据。
1. 引言
血管性痴呆（VaD）是仅次于阿尔茨海默病的第二常见痴呆亚型，主要影响老年人。随着全球人口老龄化加速，其发病率与致残率显著上升。VaD指由脑血管疾病导致的认知障碍综合征，目前临床管理主要集中在控制血管风险因素和缓解认知症状，但未能从根本上解决神经元损伤和认知衰退问题。
从天麻等传统药材中提取的单体成分具有疗效显著、安全性高、适合长期使用等优势。原儿茶醛（PAL）是天麻的活性成分之一，化学式为C7H6O3，可显著改善认知缺陷，增强学习记忆能力。不同于单靶点药物，PAL通过调节多重信号通路发挥脑缺血损伤保护作用，涉及对抗氧化应激、调控线粒体自噬、恢复能量代谢、抑制细胞焦亡以及保护血脑屏障完整性等多方面机制。值得注意的是，在脑缺血病理条件下，PAL的脑摄取会增强。尽管PAL在脑缺血中的有益作用已被证实，但其在慢性低灌注模型中缓解神经损伤的具体通路仍有待阐明。本研究旨在探索PAL能否改善认知功能障碍，并深入研究其潜在作用机制。
多组学研究是一种整合多种组学数据的多层次、多维分析方法，可全面揭示多靶点药物干预疾病的分子机制和调控网络。血浆代谢组学反映动物的全身代谢状态，而脑组织代谢组学直接揭示大脑的代谢变化。通过整合分析，可识别血浆和脑组织中的共有代谢物及其变化规律。进一步结合转录组学数据，可以从基因表达和代谢调控双重角度揭示疾病分子机制，为PAL治疗提供新见解和新方法。
因此，本研究利用2VO大鼠模型和氧糖剥夺（OGD）损伤的星形胶质细胞-神经元共培养体系，采用血浆和脑组织代谢组学结合转录组学分析，旨在阐明PAL治疗VaD的特性并破译其神经保护机制。
2. 材料与方法
本研究使用了体重250-280 g的8周龄雄性SD大鼠以及孕10-12天的孕鼠。动物实验经云南中医药大学动物伦理委员会批准。将大鼠均分为假手术组、模型组、PAL高剂量组和低剂量组。PAL高、低剂量分别设置为20 mg/kg和10 mg/kg，灌胃给药，每日一次，持续28天。采用双侧颈总动脉结扎法建立2VO模型。通过神经功能评分、水迷宫实验评估神经行为和认知功能。采用苏木精-伊红（H&E）染色观察海马CA1区神经元病理变化。
通过生化试剂盒检测脑组织中Ca2+、谷氨酰胺、乳酸、谷氨酸、ATP含量以及谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酰胺酶（GLS）的活性。委托武汉迈特维尔生物科技有限公司进行血浆和脑组织非靶向代谢组学分析，利用UPLC-MS/MS平台进行检测，通过OPLS-DA模型筛选差异代谢物，并进行KEGG通路富集分析。转录组学分析通过Illumina平台进行测序，使用DESeq2进行差异表达基因（DEGs）分析并进行KEGG富集。
通过多组学整合分析，筛选血浆与脑组织的共有代谢物，利用ROC曲线筛选具有潜在诊断意义的代谢物，并通过网络药理学方法预测其靶点，与转录组差异基因及疾病靶点取交集，筛选PAL治疗VaD的关键基因。
原代脑细胞取自E18 SD大鼠胚胎海马组织，进行星形胶质细胞与神经元共培养，并通过免疫荧光（NeuN/GFAP/DAPI）进行鉴定。细胞实验分为对照组、OGD组和PAL组，PAL给药浓度为4 μg/mL。通过将细胞置于三气培养箱（1% O2, 94% N2, 5% CO2）中6小时建立OGD模型。检测细胞上清液中谷氨酸、乳酸、ATP含量及细胞凋亡率。
通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测脑组织及共培养细胞中vGLUT1、MCT1、MCT2、MCT4、葡萄糖转运蛋白1（GLUT-1）、己糖激酶2（HK2）、磷酸果糖激酶（PFK）、丙酮酸脱氢酶（PDH）、乳酸脱氢酶A（LDHA）、乳酸脱氢酶B（LDHB）等蛋白的表达水平。通过免疫荧光技术观察MCT1、MCT2、MCT4在共培养细胞中的表达与定位。
3. 结果
3.1. PAL对2VO大鼠认知功能的影响
在水迷宫定位航行实验中，模型组的逃避潜伏期显著长于假手术组。PAL给药后，潜伏期呈明显下降趋势，高剂量组在第4天达到与假手术组相似的水平。在空间探索实验中，模型组大鼠在目标象限停留时间、穿越平台次数显著减少，游泳距离更长。PAL干预后，在目标象限停留时间和穿越平台次数显著增加，游泳距离显著缩短，表明给药后大鼠对原平台位置记忆更佳。
3.2. PAL对2VO大鼠神经功能的影响
H&E染色显示，模型组海马CA1区神经元排列紊乱，细胞体肿胀，核固缩深染，胞质出现空泡，间质明显水肿。PAL干预有效恢复了这些病理改变，高剂量组改善更为明显，神经元排列基本恢复，细胞和核形态正常，间质水肿显著减轻。模型组CA1区神经元存活密度显著降低，PAL给药后其密度显著恢复。模型组的神经功能评分极高，PAL高、低剂量组评分显著降低，表明PAL具有显著的神经保护作用。
3.3. PAL对2VO大鼠血浆和脑源性代谢物的影响
血浆代谢组学共鉴定到1483种代谢物。模型组与PAL高剂量组样本在OPLS-DA得分图中明显分离。共筛选出68种潜在差异代谢物，其中与认知障碍高度相关的包括L-谷氨酸、L-谷氨酰胺和腺苷5‘-单磷酸。差异代谢物显著富集于甘油磷脂代谢、谷氨酸能突触、氮代谢等KEGG通路。
脑组织代谢组学共鉴定到1500种代谢物。模型组与PAL高剂量组样本明显分离。共筛选出59种潜在差异代谢物，其中与认知障碍高度相关的包括果糖-6-磷酸、甘露醇、8-羟基脱氧鸟苷、卫矛醇和山梨糖醇。差异代谢物显著富集于产热、心肌细胞中的肾上腺素能信号传导、半乳糖代谢等通路。
3.4. PAL对2VO大鼠转录组学的影响
测序数据质量良好。OPLS-DA模型显示出稳健的稳定性和解释力，得分图显示两组清晰分离。比较模型组与高剂量组，共鉴定出315个表达显著改变的基因，其中48个上调，267个下调。差异表达基因显著富集于神经活性配体-受体相互作用、蛋白质消化和吸收等通路。
3.5. PAL对2VO大鼠的多组学整合分析
结合血浆和脑组织代谢组学结果，筛选出710个共存代谢物，其中59个为显著差异代谢物。选择ROC曲线下面积（AUC）=1的代谢物，预测到747个潜在靶点。将获得的靶点信息与转录组学及疾病相关靶点整合，发现18个共有差异基因，其中Slc17a7（vGLUT1）在网络中连接度最高。进一步的通路关联分析表明，PAL可能通过调节血浆-脑共有代谢物，影响谷氨酸代谢等过程来发挥治疗作用。网络视图显示，谷氨酸代谢与糖酵解、三羧酸循环、糖异生、线粒体电子传递链以及果糖和甘露糖代谢与降解通路密切相关。
3.6. PAL对2VO大鼠谷氨酸代谢的影响
与假手术组相比，模型组脑内谷氨酸和Ca2+水平更高，GLS活性升高，而谷氨酰胺含量和GS活性降低。PAL给药后，高剂量组谷氨酰胺含量和GS活性显著升高，谷氨酸水平、Ca2+含量和GLS活性显著降低。低剂量组谷氨酸含量和GLS活性也显著降低。
2+含量；（F）ATP含量；（G）乳酸含量。">
3.7. PAL对2VO大鼠糖酵解水平的影响
与假手术组相比，模型组脑内乳酸和ATP含量显著降低。PAL给药后，这些水平显著恢复，高剂量组变化尤其明显。模型组大鼠脑组织中糖酵解相关蛋白LDHA、LDHB、GLUT-1、HK2、PFK、PDH的表达显著降低。在PAL高剂量组，这些蛋白的相对表达水平相较于模型组显著升高。
3.8. PAL对2VO大鼠谷氨酸释放和乳酸穿梭的影响
与假手术组相比，模型组脑组织中vGLUT1蛋白相对水平显著升高，而MCT1、MCT2、MCT4蛋白水平显著降低。与模型组相比，PAL组vGLUT1蛋白相对水平显著降低，MCT1、MCT2、MCT4蛋白相对水平显著升高。
3.9. PAL对OGD诱导的共培养细胞损伤的影响
共培养细胞鉴定显示，星形胶质细胞和神经元细胞的阳性率分别为65.97±1.29%和34.03±1.29%。与对照组相比，OGD组共培养的星形胶质细胞和神经元细胞凋亡显著增加。与OGD条件相比，药物（PAL）组细胞凋亡显著减少。
3.10. PAL对OGD共培养细胞上清中谷氨酸、乳酸和ATP水平的影响
与对照组相比，OGD组上清中谷氨酸含量增加，而乳酸和ATP降低。药物（PAL）干预后，与OGD组相比，谷氨酸含量下降，乳酸和ATP水平上升。
3.11. PAL对OGD共培养细胞谷氨酸释放和乳酸穿梭的影响
免疫荧光染色结果显示，MCT1和MCT4与星形胶质细胞标记物GFAP明显共定位，而MCT2主要与神经元细胞共定位。与OGD组相比，药物（PAL）组共培养的星形胶质细胞和神经元中vGLUT1蛋白表达水平显著降低，MCT1、MCT2、MCT4蛋白表达水平显著升高。
与对照组相比，OGD组vGLUT1蛋白表达升高，MCT1、MCT2、MCT4水平降低。药物（PAL）干预显著逆转了OGD诱导的这种表达模式，与OGD条件相比，vGLUT1降低，MCT1、MCT2、MCT4水平升高。
3.12. PAL对OGD共培养细胞糖酵解的影响
在共培养体系中，与对照组相比，OGD组GLUT-1、HK2、PFK、LDHA、LDHB、PDH蛋白表达显著降低。药物（PAL）干预后，与OGD组相比，这些蛋白的表达水平升高，恢复到接近对照组的水平。
4. 讨论
本研究采用慢性脑低灌注模型中的整合多组学策略，阐明PAL通过调节vGLUT1介导的谷氨酸代谢以及涉及MCTs的星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭来改善能量代谢的新机制。通过大鼠行为学观察、海马CA1区病理染色以及体外TUNEL染色等指标检测，发现PAL可以减少神经元损伤、减少细胞凋亡并改善行为学表现，显示出其治疗VaD相关认知功能障碍的潜力。
为了破译PAL的神经保护机制，我们以血浆和脑组织的共有代谢物为关键纽带，研究PAL治疗VaD的核心代谢网络。我们鉴定出8个与认知功能障碍高度相关的共有代谢物：L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、腺苷5‘-单磷酸、果糖-6-磷酸、甘露醇、8-羟基脱氧鸟苷和卫矛醇。在通路富集中发现，共有代谢物显著富集于谷氨酸代谢，该通路与糖酵解等多种能量代谢通路密切相关。
基于以上结果，我们推测PAL治疗VaD与谷氨酸代谢和能量代谢密切相关。进一步综合分析转录组学结果，我们发现囊泡谷氨酸转运体vGLUT1可能是PAL治疗VaD的核心分子靶点之一。vGLUT1是负责中枢神经系统谷氨酸装载和释放的关键调节蛋白。在VaD病理条件下，谷氨酸过量通常导致神经元损伤和认知功能障碍。研究表明，慢性低灌注大鼠海马中vGLUT1水平急剧上调。vGLUT1过表达会促进谷氨酸的过度释放，引发兴奋性毒性，最终导致神经元死亡。因此，下调vGLUT1表达可以减少谷氨酸向突触小泡的装载及其随后的释放，从而降低神经元兴奋性，有效防止谷氨酸过度释放引起的神经损伤。
维持谷氨酸的动态平衡不仅依赖于对其释放的调节，还依赖于其及时转化为谷氨酰胺等代谢物。在GS催化下，谷氨酸与铵离子结合形成谷氨酰胺。GS活性的增加不仅有助于清除潜在神经毒性的谷氨酸，还能产生具有神经保护作用的谷氨酰胺。在增强GS活性的同时，也需要抑制GLS的活性，以减少谷氨酰胺向谷氨酸的转化。我们的实验结果表明，PAL可能通过下调vGLUT1的活性来减少谷氨酸的释放，同时促进谷氨酸分解为谷氨酰胺，最终减少神经元兴奋性损伤和细胞凋亡，改善VaD。
最近研究表明，谷氨酸代谢与乳酸穿梭之间存在紧密的功能偶联。来自血浆和脑组织的共有代谢物也提示PAL可能通过葡萄糖代谢通路发挥作用。谷氨酸代谢是高度耗能的过程，需要大量ATP。为了满足这种急剧增加的能量需求，星形胶质细胞必须增强糖酵解以快速供能。能量代谢耗竭也是脑慢性低灌注的关键病理环节。
星形胶质细胞增加乳酸产量以支持神经元的能量供应至关重要。我们的体内外实验结果表明，PAL干预后，糖酵解通路中的蛋白表达上调。首先通过GLUT-1促进细胞对葡萄糖的摄取。HK2催化葡萄糖磷酸化，这是糖酵解的第一步。PFK是糖酵解的关键限速酶，通过感应ATP/AMP比值变化来调节糖酵解速度。最后，LDHA还原为乳酸，为穿梭提供能量原料。随后乳酸的快速利用也是穿梭机制的关键环节。摄入的乳酸被LDHB氧化回丙酮酸。这些丙酮酸被PDH快速送入三羧酸循环，为神经元细胞产生大量ATP。通过乳酸穿梭机制，可以促进脑细胞间的能量供应，有效应对慢性低灌注中的神经元能量危机。
除了乳酸的产生和利用，其传递过程同样重要。星形胶质细胞产生乳酸后，需要被有效地运输到神经元利用。乳酸穿梭机制指乳酸通过MCTs在星形胶质细胞和神经元之间的转运和代谢。在各种MCTs中，MCT1和MCT4是星形胶质细胞外排乳酸的主要靶点，维持细胞内乳酸稳态并将乳酸作为高耗能脑细胞的能量底物。MCT2作为一种高亲和力的转运蛋白，在神经元中表达以促进乳酸摄取。PAL干预后，MCT1、MCT2和MCT4的协同上调显著提高了细胞内乳酸的转运效率，从而增加了星形胶质细胞对神经元的能量供应。我们的观察主要反映了PAL在缺氧条件下对星形胶质细胞层面的作用。PAL通过调节糖酵解蛋白和MCT转运蛋白，改善乳酸利用途径，从而增强神经元的能量供应，改善VaD的认知功能障碍。我们目前的数据基于共培养体系，反映了细胞间的相互作用。未来的验证将需要更精细的细胞特异性模型。
5. 结论
通过整合多组学数据，我们发现PAL在治疗VaD方面显示出显著的疗效。它可以调节vGLUT1，控制谷氨酸的释放，增强谷氨酸代谢，并与糖酵解和乳酸穿梭通路相偶联。这些效应共同优化了脑细胞间的能量分配，最终改善了认知功能。本研究阐明了PAL治疗VaD的机制，为其临床应用推广提供了可靠的科学依据。
