硫酸盐型盐碱环境下蜡样芽孢杆菌PT1菌株对铜绿微囊藻的杀藻特性与代谢机制研究

《Microorganisms》：Algicidal Characteristics of Bacillus cereus Strain PT1 Against Microcystis aeruginosa in Sulfate-Type Saline–Alkaline Environments Qing Wang, Yucheng Cao, Yunna Xu, Keng Yang, Chuangwen Xu, Guoliang Wen, Jinfan Liu, Jianshe Zhang and Xiaojuan Hu

这篇综述探讨了从盐碱池塘分离的本土菌株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）PT1，在硫酸盐型盐碱环境中对铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）水华的生物控制潜力。研究通过非靶向代谢组学揭示了其杀藻作用与群体感应（QS）、双组分系统（TCS）、ABC转运蛋白以及色氨酸代谢等通路相关的“调控-转运-代谢重塑”协同框架，为开发盐碱水域微生物控藻制剂提供了重要理论依据。

　　

在盐碱水体的生态管理中，生物控制铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）水华仍是一项重大挑战。本研究从硫酸盐型盐碱池塘分离出一株本土杀藻细菌——蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）PT1，系统评估了其在盐碱条件下对铜绿微囊藻的杀藻性能，并利用非靶向代谢组学阐明了其潜在的代谢机制。

1. 引言

中国拥有大面积的盐碱土壤，其水体的化学组成复杂，具有高pH、高碳酸盐碱度和高离子强度的“三高”特征。这类水体并非简单的“含盐淡水”或“稀释海水”，而是以HCO₃^?/CO₃^2?为主的碳酸盐缓冲体系。在这种环境下，铜绿微囊藻表现出极强的环境适应性，成为优势藻类，并在夏季高温时频繁引发水华。其产生的微囊藻毒素（MCs）会破坏水生微生态系统平衡，威胁水产养殖安全和人类健康。因此，开发高效、环保的盐碱池塘铜绿微囊藻水华控制策略具有重要的现实意义。当前，物理和化学控藻方法存在诸多局限，而生物方法，特别是利用杀藻细菌，因其高效性和可持续性成为研究焦点。然而，现有研究多集中于淡水或海洋环境，针对盐碱水体的杀藻细菌研究相对有限，尤其在土著菌株的分离筛选、杀藻活性物质的鉴定及其在盐碱系统中的分子作用机制方面亟待深入。

2. 材料与方法

实验菌株PT1由中国水产科学研究院海水池塘养殖生态环境调控创新团队提供，分离自宁夏银川市贺兰县的盐碱池塘微藻环境。实验藻种为铜绿微囊藻，使用BG11培养基在28 ± 1°C、光强2000–2500 lx、光暗周期12:12 h的条件下活化与增殖。实验采用硫酸盐型盐碱水系统，并建立了菌藻共培养体系。通过血球计数板计数藻细胞密度，并参照国标GB4789.14-2014在甘露醇卵黄多黏菌素琼脂平板上计数蜡样芽孢杆菌。杀藻率R（%）的计算公式为：R（%）=（C₀? C_t）/C₀× 100，其中C₀和C_t分别代表初始和第t天的藻细胞浓度。在菌藻共培养的第0、2、4天取样，进行非靶向代谢组学分析。原始LC-MS数据经预处理、峰对齐和特征积分后，进行总峰面积归一化和Log₂(x + 1)转换，随后进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。通过韦尔奇t检验和错误发现率（FDR）校正筛选差异代谢物，并利用京都基因与基因组百科全书（KEGG）进行通路富集分析。

3. 结果

3.1. 铜绿微囊藻细胞数量的变化

接种PT1的实验组藻细胞密度在4天内从2 × 10⁶cells mL^?1显著降至1.25 ± 0.5 × 10⁵cells mL^?1，杀藻率达到93.75 ± 2.5%，而对照组藻生物量保持稳定。

3.2. 蜡样芽孢杆菌种群数量的变化

PT1组的初始细菌浓度为1.86 ± 0.27 × 10⁷CFU/mL，至第4天下降至5.05 ± 0.21 × 10⁵CFU/mL，表明杀藻过程主要依赖代谢产物的积累而非细菌增殖。对照组未检测到蜡样芽孢杆菌。

3.3. 杀藻率

在菌藻共培养系统中，接种组（PT1）的杀藻率在第2天为80.63%，第4天达到93.75 ± 2.5%。

3.4. 藻瓶颜色与外观变化

培养过程中，对照组颜色由浅绿逐渐加深为深绿，而接种组颜色从浅绿逐渐褪为黄白色，瓶底出现黄白色絮状物，直观表明了藻细胞结构的损伤。

3.5. 代谢组学分析

3.5.1. 主成分分析（PCA）

质控（QC）样品紧密聚集，表明实验数据检测方法稳定、质量高。OPLS-DA模型实现了PT1_2与PT1_4组间的良好分离，模型具有较强的拟合度（R²Y = 0.997）和可接受的预测能力（Q²= 0.778）。

3.5.2. 代谢物分类统计与注释

在杀藻系统中鉴定出的代谢物主要分为有机酸及其衍生物（23.12%）、有机杂环化合物（22.13%）、脂质及类脂分子（12.25%）、苯环型化合物（8.3%）和有机氧化合物（8.69%）等。层次聚类热图显示，PT1处理组与对照组在整体代谢谱水平上分离明显，且PT1处理组内不同时间点的样品代谢特征更为相似。

3.5.3. 差异代谢物筛选

通过严格的组内时间序列筛选和对照组趋势剔除，共鉴定出298个PT1诱导的累积代谢特征，其中107个具有高置信度的MS1/MS2注释。根据上调幅度排序，筛选出前30个候选代谢物，包括苯甲酸、香豆素、丙二酸等有机酸和芳香族化合物，以及吲哚乙醛、硝普钠等信号相关分子。维恩图显示了不同时间点比较组合中独特差异代谢物的数量。前30个差异表达代谢物的热图显示，它们在PT1条件下呈现一致的积累模式，而在对照组中未观察到相同的时间点增加模式。

3.5.4. KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析表明，差异代谢物显著富集于氨基酸和核苷酸代谢以及跨膜转运相关通路。具体而言，甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸生物合成、ABC转运蛋白以及核苷酸相关代谢通路表现出较高的富集度。时间序列KEGG注释热图进一步显示，这些富集功能并非静态，而是随着处理和时间动态变化，在后期PT1组与对照组之间的整体差异更为清晰。

3.5.5. 杀藻相关通路筛选

基于文献综述，在KEGG框架下总结的杀藻相关功能可分为三类：第一，调控模块，主要包括群体感应（QS， map02024）和环境信号响应（如双组分系统TCS， map02020）；第二，物质输出与跨膜转运模块，以ABC转运蛋白（map02010）为代表；第三，活性小分子及其前体代谢模块，常涉及芳香族和吲哚代谢（如色氨酸代谢map00380、芳香族化合物降解map01220）、氨基酸及其衍生物代谢（如赖氨酸生物合成map00300、赖氨酸降解map00310）以及萜类骨架生物合成（map00900）。PT1诱导的杀藻过程代谢特征，正富集于以“调控（QS/TCS）-转运（ABC）-小分子代谢（吲哚/芳香族化合物、氨基酸、萜类前体）”为核心的协同功能链中。

4. 讨论

4.1. PT1菌株的盐碱耐受性与高杀藻潜力

PT1菌株在共培养系统中表现出优异的适应性，在第4天实现了93.75%的高铜绿微囊藻去除率。这支持了“土著菌株”策略在盐碱条件下控制蓝藻水华的可行性，并表明芽孢杆菌属可能是开发盐碱水体控藻剂的优势种质资源。

4.2. 基于代谢组学的潜在活性物质分析

研究鉴定出的特征代谢物可能构成一个多靶点攻击网络。例如，苯甲酸和丙二酸的积累可能引发有机酸胁迫，破坏细胞膜通透性和抑制光系统II（PSII）活性。吲哚-3-乙酸（IAA）及其衍生物作为跨界信号分子，可能在较高浓度下干扰微藻细胞周期，诱导程序性细胞死亡（PCD）。此外，潜在的杀藻肽前体（如脂肽抗生素）也可能参与作用。未来工作需要通过纯化合物补充实验验证这些候选物的因果作用。

4.3. PT1菌株诱导的代谢重塑及其潜在杀藻效应

杀藻表型与细胞代谢的系统性重塑在时间上一致。QS、TCS和ABC转运蛋白的共富集表明杀藻细菌在环境信号下具有协调响应和增强的外排能力。色氨酸代谢、芳香族化合物降解、赖氨酸代谢以及萜类骨架生物合成通路的显著富集，为潜在杀藻活性物质（如吲哚类、酚类衍生物、赖氨酸、三萜皂苷结构）的产生提供了化学指示。综上所述，PT1的杀藻效应由信号转导系统（QS/TCS）驱动，通过ABC转运系统增强物质交换，并利用重塑的芳香族、含氮和萜类代谢网络产生潜在的杀藻效应因子。

5. 结论

本研究评估了从盐碱环境分离的土著蜡样芽孢杆菌PT1菌株对铜绿微囊藻的杀藻效果及代谢机制。PT1表现出显著且稳定的杀藻效果，4天内杀藻率达93.75 ± 2.5%。非靶向代谢组学筛选出298个PT1诱导的累积代谢特征，前30个代谢物包括苯甲酸、香豆素、丙二酸等有机酸/芳香族化合物以及吲哚-3-醛、硝普钠等信号相关分子。KEGG通路富集分析显示，差异代谢物显著富集于群体感应（QS）、双组分系统（TCS）、ABC转运蛋白和色氨酸代谢等八个已报道的杀藻相关通路。PT1分泌的杀藻活性代谢物呈现出以“调控（QS/TCS）-转运（ABC）-小分子代谢（吲哚/芳香族化合物、氨基酸和萜类前体）”为核心的途径富集特征。该研究为进一步阐明盐碱条件下藻类溶解活性的分子特征提供了理论基础。未来工作将集中于分离特定的杀藻效应物、验证其生物安全性，并通过遗传修饰增强菌株在动态盐碱生态系统中的适应性和功效。