《Journal of Fungi》：Phylogenetic Relationships of Five Phallales Species Based on Mitochondrial Genome Analysis
Yaping Wang,
Dan Li,
Guoyu Wang,
Zhongyao Guo,
Xianyi Wang and
Hongmei Liu
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本研究通过对鬼笔目五种物种进行线粒体基因组（mitogenome）测序、组装、注释与比较分析，揭示了其线粒体基因组的大小、结构变异与基因组成，并利用线粒体基因组数据构建了高支持度的系统发育树，明确了鬼笔目与钉菇目（Gomphales）的亲缘关系最近。该研究为理解鬼笔目这一重要真菌类群的进化动力学、遗传构成及系统分类学提供了新的基因组学基础。
引言
鬼笔目真菌全球分布，是森林生态系统的重要组成部分，许多物种兼具食药用价值，但部分物种（如竹林蛇头菌Lysurus mokusin）也具有毒性。该目真菌形态特征有限，且野外采集样本受发育阶段、环境因素影响大，传统形态学分类面临挑战。尽管已利用内部转录间隔区（ITS）、大亚基核糖体RNA（LSU）等分子标记进行研究，但其有限的遗传信息难以解析类群间关系。线粒体基因组（mitogenome）因其进化速率较快、转录谱相对保守，已成为真菌系统发育研究的有效工具。然而，NCBI数据库中仅有3个鬼笔目物种的线粒体基因组记录，信息严重不足。本研究对来自中国贵州、云南、福建的竹林蛇头菌、长裙竹荪（Phallus indusiatus）、白鬼笔（P. hadriani）、硬裙竹荪（P. rigidiindusiatus）和皱盖鬼笔（P. rugulosus）这五个物种进行了线粒体基因组测序、组装与分析，旨在阐明其线粒体基因组特征，并基于完整的线粒体基因组序列揭示伞菌纲内的进化关系。
材料与方法
样本采集自中国多省，菌株凭证标本保存于贵州医科大学实验室。使用基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并通过Illumina HiSeq 4000平台进行全基因组测序。此外，从NCBI数据库获取了冬笋竹荪（P. dongsun）和棘托竹荪（P. echinovolvatus）的基因组序列用于比较分析。线粒体基因组使用Geneious Prime软件组装，并在Galaxy平台上使用MITOS和Mfannot进行结构注释。基本组成分析、密码子使用、非同义（Ka）与同义（Ks）替换率计算等均在相应软件中完成。为进行系统发育分析，从NCBI下载了涵盖担子菌门10个目共116个物种的线粒体基因组，构建了三个数据集：PCG12（15个蛋白质编码基因的第一、二位密码子）、PCG12R（PCG12序列加两个rRNA基因）和AA（15个PCGs的氨基酸序列）。使用最大似然法和贝叶斯推断法构建系统发育树。
结果
1. 鬼笔目线粒体基因组特征与PCGs
组装获得的五个线粒体基因组均为环状DNA分子，大小从41,465 bp到99,150 bp不等，其中白鬼笔的基因组是硬裙竹荪的2.25倍。所有基因组的GC含量相对较低（24.1%-25.1%）。每个线粒体基因组均包含一套完整的15个核心蛋白质编码基因（PCGs）：atp6、atp8、atp9、cob、cox1-3、nad1-6、nad4L和rps3。比较不同地理来源的竹林蛇头菌和长裙竹荪菌株发现，其线粒体基因组大小存在显著差异，这种变异主要源于大亚基核糖体RNA基因（rnl）及其邻近区域内的序列插入/缺失，以及cox1基因内含子的获得或丢失。
2. 鬼笔目线粒体基因组中的rRNA与tRNA基因
五个基因组均编码两个rRNA基因：rnl和rns。rnl基因长度变异较大，而白鬼笔的该基因被显著截短至1403 bp。rns基因长度在多数物种中高度保守，但竹林蛇头菌的rns基因比其他四种短约40 bp。仅在长裙竹荪的rns和rnl基因中发现了内含子。tRNA基因数量在24-25个之间，大多数tRNA基因长度高度保守（71-74 bp），但竹林蛇头菌和皱盖鬼笔的trnL基因显著缩短至61 bp。tRNA基因在基因组中形成六个簇。在所有鬼笔目中，trnM、trnL、trnR和trnS均发生了重复。此外，皱盖鬼笔、白鬼笔、硬裙竹荪和冬笋竹荪的线粒体基因组中分别额外重复了trnI、trnT、trnD和trnF基因。
3. 密码子使用分析
在五个鬼笔目物种中，核心PCGs最常用的起始密码子是ATG，其次是TTA和ATT；最常用的终止密码子是TAA。密码子使用分析显示，所有五个物种中使用频率最高的密码子是编码亮氨酸的TTA，其次是编码苯丙氨酸的TTT、编码天冬酰胺的AAT等。密码子中A和T的高频使用导致了鬼笔目线粒体基因组较高的AT含量（>70%）。
4. 线粒体基因组组成分析
在白鬼笔中，基因间区占基因组比例最大（41%），其次是内含子区（38%）。在竹林蛇头菌、长裙竹荪和皱盖鬼笔中，内含子区是基因组最大组成部分。而在基因组最小的硬裙竹荪中，蛋白质编码区比例最大（38%）。分析表明，内含子区和基因间区是导致五个鬼笔目物种线粒体基因组大小变异的重要因素。
5. 内含子插入位点分析
内含子存在于所有五个物种的线粒体基因组中，数量差异显著。竹林蛇头菌的15个PCGs中含有最多内含子（24个），而硬裙竹荪最少（5个）。cox1基因含有相对较多的内含子插入位点，其中竹林蛇头菌最多（9个）。atp6、atp8、atp9、nad3、nad4L、nad6和rps3在所有物种中均无内含子。
6. 核心PCGs的变异与进化速率
对七个鬼笔目物种的15个PCGs分析表明，atp6、atp8和nad3长度保守，而nad2基因长度变异最大（达996 bp）。非同义替换率（Ka）分析显示，cox1基因的Ka值最高，atp9基因的Ka值最低（Ka=0）。所有15个PCGs的Ka/Ks比值均小于1，表明纯化选择是作用于这些基因的主要进化力量。遗传距离（K2P）分析显示，nad4、atp6和rps3的遗传距离较大，而cox3和nad4L高度保守。
7. 鬼笔目基因排列分析
对七个鬼笔目物种的基因排列分析显示，所有物种的15个核心PCGs和2个rRNA基因的排列顺序完全一致。24个tRNA基因的排列顺序在所有七个物种中也完全相同。除了前述四个tRNA（trnM、trnL、trnR、trnS）的重复是共有特征外，皱盖鬼笔、白鬼笔、硬裙竹荪和冬笋竹荪还分别发生了trnI、trnT、trnD和trnF的额外重复事件。这表明鬼笔目线粒体基因组在进化中保持了高度的结构稳定性。
8. 系统发育关系分析
基于15个PCGs和rRNA基因联合数据集构建了包含114个伞菌纲物种的系统发育树。系统发育分析强烈支持伞菌目与牛肝菌目是姐妹群。鬼笔目与钉菇目（Gomphales）聚集在同一分支，支持值为1，表明这两个目亲缘关系最近。在鬼笔目内部，竹林蛇头菌首先聚为一支，然后与鬼笔属物种聚类。鬼笔属内部，长裙竹荪首先形成一个亚支，然后与其他五个鬼笔属物种聚在一起。皱盖鬼笔形成了一个独立的分支，而其他五个物种聚在另一分支。该结果与基于ITS-LSU序列的先前系统发育分析一致，表明线粒体基因组是推断伞菌纲进化关系的有效分子标记。
讨论
本研究首次报告了白鬼笔、硬裙竹荪和皱盖鬼笔的线粒体基因组特征。鬼笔目真菌线粒体基因组大小变异显著，内含子和基因间区是导致其大小变异的主要因素。即使在同种的不同地理菌株间，线粒体基因组大小也存在变异，这可能与地理隔离和生态适应有关。rRNA基因中，rns基因高度保守，而rnl基因长度变异较大，白鬼笔的该基因甚至发生了严重缩短。tRNA基因长度高度保守，但竹林蛇头菌和皱盖鬼笔的trnL基因缩短，这可能代表了早期分支谱系的一个特征。所有鬼笔目物种共享四个tRNA（trnM、trnL、trnR、trnS）的重复，这可能是该目进化过程中形成的共衍征。核心PCGs、rRNA基因和24个tRNA基因的排列顺序在鬼笔目物种中完全一致，显示出强大的纯化选择压力。内含子，特别是I组内含子，在鬼笔目线粒体基因组中广泛存在且数量可变，cox1和cob基因尤为富含内含子。长裙竹荪rRNA基因中的内含子可能是近期通过水平转移获得的。系统发育分析支持鬼笔目与钉菇目亲缘关系最近。然而，基于线粒体基因组和基于核基因（如LSU-ITS）的系统发育树在鬼笔属内部存在不一致之处。因此，整合形态特征、生态数据和多种分子标记的综合分类框架对于可靠界定鬼笔目物种至关重要。
结论
本研究成功测序并表征了鬼笔目的五个线粒体基因组，其中三个为新报道。这些线粒体基因组在遗传内容、基因长度、tRNA组成和密码子使用上存在显著变异。内含子和基因间区是影响这些真菌线粒体基因组大小的关键因素。比较基因组学分析显示，七个鬼笔目真菌的基因排列高度保守，涵盖了15个核心PCGs、2个rRNA基因和24个tRNA基因。在皱盖鬼笔、白鬼笔、硬裙竹荪和冬笋竹荪中发现了额外的tRNA重复事件。系统发育分析表明鬼笔目与钉菇目物种具有更近的进化关系。然而，对于鬼笔属，基于线粒体与核基因序列推断的系统发育关系并不完全一致。解决这一矛盾对于阐明该属内的系统发育关系至关重要。本研究为未来鬼笔目及相关真菌目进化、遗传学和分类学研究建立了基础框架。
