《Biology》：ATF4 Is Dispensable for Spermatogenesis but Protective Against ER Stress Under Normal Conditions
Mingxing Zhang,
Zhicheng Wu,
Yilan Teng,
Hongwen Zhu and
Peng Dai
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本综述揭示了新兴溴代阻燃剂TBPH的慢性肝毒性机制。研究证实，长期TBPH暴露不仅引发肝脏脂肪变性，更能通过激活PPARγ信号通路，刺激DGAT2介导的甘油三酯合成与脂滴(LD)生物生成，并上调Mfap4信号通路，最终驱动肝脏从单纯性脂肪肝(MASLD)向代谢功能障碍相关脂肪性肝炎(MASH)及纤维化的病理级联。该研究为理解环境污染物在MASLD/MASH发展中的作用提供了新的分子机制见解。
引言：广泛存在的肝脏健康新威胁
双(2-乙基己基)-2,3,4,5-四溴邻苯二甲酸酯(TBPH)作为一种广泛使用的新型溴代阻燃剂，已成为普遍存在的环境污染物，在空气、土壤、沉积物、地表水乃至人体中均有检出。代谢功能障碍相关脂肪性肝病(MASLD)的全球成人患病率约为30%，已成为全球性的重大公共卫生问题。虽然急性TBPH暴露已被证实可干扰脂质信号传导，但其长期暴露对MASLD进展的影响仍不甚明了。斑马鱼因其与人类在脂质代谢途径上的高度基因保守性，成为研究肝脏发育、再生及脂肪变性病因学的有力模型。本研究旨在阐明TBPH慢性肝毒性的效应及其潜在的分子机制。
材料与方法
本研究采用成年野生型(TU品系)雌性斑马鱼，将其暴露于0 μM (对照组)、0.02 μM (低浓度组)或2 μM (高浓度组)的TBPH环境中，持续6周。肝损伤通过组织学检查(苏木精-伊红(HE)染色和Masson三色染色)、生化分析(ALT、AST、IL-1、TNFα)以及整合的蛋白质组学和转录组学分析进行评估。同时，利用HepG2细胞进行体外实验，以验证TBPH对脂滴(LD)动力学的细胞机制。肝组织蛋白提取后，通过基于串联质谱标签(TMT)的定量蛋白质组学技术进行差异蛋白分析，并使用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)等方法进行生物信息学分析。所有统计均采用SPSS 26软件进行，p值小于0.05被认为具有统计学显著性。
结果
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TBPH暴露破坏斑马鱼肝脏稳态
暴露6周后，与对照组相比，低浓度和高浓度暴露组的斑马鱼体重均显著增加(p < 0.05)，而两暴露组之间无统计学差异。同时，两暴露组的肝脏指数均较对照组显著降低(p < 0.01)。在炎症指标方面，TBPH暴露导致肝脏促炎细胞因子IL-1水平显著升高(p < 0.001)，且呈现明显的剂量依赖性(p < 0.01)。TNFα水平在两个暴露组中也均显著高于对照组(p < 0.001)。肝酶活性评估显示，高浓度组的ALT活性较对照组和低浓度组均显著升高(p < 0.001)；AST活性在低浓度组已显著升高(p < 0.05)，并在高浓度组进一步显著上升(p < 0.0001)。
- 2.
TBPH暴露导致斑马鱼肝脏脂肪变性和纤维化
HE染色结果显示，两个暴露组的肝细胞中均出现显著的脂质积累，脂滴(LD)的密度和直径显著增加。肝脏脂肪变性百分比在低浓度组已较对照组显著升高(p < 0.001)，且在高浓度组中进一步显著增加，呈现剂量依赖性。肝细胞脂滴的平均直径也在TBPH暴露后呈剂量依赖性增加。Masson三色染色进一步证明，低浓度组的胶原沉积(蓝色染色)局限于门静脉区域，而高浓度组的胶原阳性区域已延伸至门静脉区域之外，表明肝纤维化的早期发生。
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TBPH影响斑马鱼肝脏脂质代谢
基因表达分析显示，TBPH暴露显著上调了肝脏中过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)家族的两个关键成员pparaa和pparg的表达(p < 0.05)。pparg的表达呈明显的剂量依赖性增加。脂肪酸结合蛋白11a(fabp11a)的表达在低浓度组保持基线水平，但在高浓度组显著上调(p < 0.01)。乙酰辅酶A羧化酶α(acaca)的表达在两个暴露组中均显著上调(p < 0.05)。同时，固醇调节元件结合转录因子2(srebf2)和载脂蛋白A-1a(apoa1a)的转录水平也呈剂量依赖性显著上调(p < 0.05)。肉碱棕榈酰转移酶1Aa(cpt1aa)的表达在低浓度组未受影响，但在高浓度组较对照组和低浓度组均显著增加(p < 0.05)。
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TBPH在体外刺激脂滴生物生成
免疫荧光成像显示，TBPH暴露以剂量依赖性方式增加了HepG2细胞中的脂滴积累。在未处理的对照组中，内质网(ER)形态明确，仅有基础的脂滴形成。低浓度组诱导了内质网附近小脂滴的初始积累。在高TBPH浓度下，脂滴在数量和大小上均显著增加，并与内质网有明显的共定位。实时定量PCR分析揭示了TBPH暴露后HepG2细胞转录水平的变化。PPARA、DGAT2(二酰基甘油O-酰基转移酶2)和CIDEA(细胞死亡诱导DFFA样效应子A)的表达在TBPH暴露后呈现显著的剂量依赖性增加，高浓度组的表达水平显著高于低浓度组和对照组。PLIN5(脂滴包被蛋白5)的表达在低浓度和高浓度组均上调，两组间无显著差异。相比之下，PLIN2(脂滴包被蛋白2)的转录水平在低浓度组与对照组相比保持不变，但在高浓度组较对照组和低浓度组均显著升高(p < 0.001)。
- 5.
TBPH通过Mfap4信号通路刺激纤维化进程
无监督层次聚类分析显示，高浓度组和低浓度组的差异表达蛋白具有一致的表达模式，且明显区别于对照组。主成分分析(PCA)进一步证实了这一聚类模式，低浓度组与对照组聚类接近，而高浓度组则与另外两组分离最远。PLS-DA分析鉴定出，与对照组相比，高浓度组中可变重要性投影(VIP)得分最高的蛋白质是Mfap4(微纤维相关蛋白4， VIP > 1.8)。火山图分析进一步表明，Mfap4、Mfn1(线粒体融合蛋白1)和Mfi2(黑色素转铁蛋白)是高浓度组中上调最显著的蛋白质。KEGG通路富集分析显示，高浓度组与对照组之间的差异表达蛋白显著富集于脂质代谢相关通路，包括脂肪酸生物合成和亚油酸代谢。
讨论
本研究发现慢性TBPH暴露不仅诱导脂肪变性，更会加剧向代谢功能障碍相关脂肪性肝炎(MASH)和纤维化的转变。血清ALT和AST活性以及促炎细胞因子(TNFα, IL-1)的显著升高证实了TBPH暴露诱导了肝细胞损伤。TBPH暴露同时激活了肝脏脂质合成和氧化信号通路。pparg轴及其下游靶点acaca的上调表明，从头脂肪生成是主要驱动因素。尽管与脂肪酸氧化和转运相关的基因(如cpt1aa, fabp11a, apoa1a)也被上调，但严重的肝脂肪变性和脂滴扩张持续存在，表明TBPH诱导的脂肪生成可能超过了肝细胞的脂质氧化和分泌能力。
HepG2细胞的体外实验为这种积累的细胞动力学提供了高分辨率的见解。TBPH暴露以浓度依赖性方式刺激脂滴生物生成，其特征是DGAT2、PLIN2和PLIN5的上调。免疫荧光成像显示，高浓度TBPH暴露诱导形成大量增大的脂滴，并与内质网共定位。这种内质网-脂滴共定位以及CIDEA的上调促进了脂质转移和脂滴融合，推动了大泡性脂肪变性的形成。
另一个关键发现是高浓度暴露组出现了肝纤维化。蛋白质组学分析确定Mfap4是高浓度组与对照组之间排名最高的差异表达蛋白。Mfap4是一种位于弹性纤维中的细胞外基质蛋白，已被证实是肝纤维化的关键触发因子。在病理条件下，Mfap4由活化的肝星状细胞分泌，通过自我维持的反馈环促进其运动并增强抗凋亡能力，从而维持肝星状细胞的活化状态。这种持续活化功能性地映射到经典的纤维化级联反应上，驱动肝星状细胞向表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的肌成纤维细胞转分化，最终导致大量I型胶原和其他结构性细胞外基质蛋白的沉积。下游核因子κB(NF-κB)信号通路的激活不仅通过抗凋亡作用使纤维化细胞持续存活，还放大了促炎信号(IL-1/TNFα)，导致胶原沉积和纤维化进展。
此外，蛋白质组学数据揭示了线粒体重塑的关键作用。Mfn1的上调提示了线粒体动力学的病理改变。虽然线粒体融合通常是细胞对代谢压力以最大化氧化能力的一种反应，但在脂质过载的背景下，上调的Mfn1可能促进线粒体与脂滴的栓系。这种接触为支持甘油三酯合成和脂滴扩张的酶提供了三磷酸腺苷(ATP)。同时，由线粒体功能障碍诱导的氧化应激可以激活潜在的转化生长因子-β(TGF-β)，进一步刺激肝星状细胞，驱动纤维化结果。
结论
本研究提供了令人信服的证据，表明慢性TBPH暴露作为一种强效的环境干扰物，破坏了肝脏稳态，在斑马鱼中驱动了从单纯性脂肪变性向纤维性脂肪性肝炎(MASH)的进展。虽然先前的研究已建立了TBPH与脂质失调之间的联系，但我们的研究结果阐明了一个独特的机制，即长期暴露会显著加剧肝脏损伤，使其超出代谢适应的能力范围。TBPH暴露激活了pparg信号通路，驱动了广泛的从头脂肪生成，超过了肝细胞的适应阈值。这种未解决的脂质负担引发了慢性炎症，并激活了Mfap4信号通路，从而促进肝星状细胞活化和胶原沉积。最终，这一级联反应以肝纤维化进程告终。这些发现强调了TBPH作为纤维化刺激物的潜力，对水生生物乃至人类的MASLD进展构成重大风险。
