《Biology》：Evolution and Comparative Analysis of Sheep Reference Genomes: From Fragmented Assemblies to Telomere-to-Telomere Genomics
Dan Yue,
Ying Lu,
Yuqing Chong,
Jiao Wu,
Zhendong Gao,
Ruoshan Ma,
Keyu Li,
Weidong Deng and
Bo Wang
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本研究发现，长期暴露于环境相关浓度的新型溴化阻燃剂TBPH，会在成年斑马鱼中驱动一种从单纯脂肪变性到纤维性脂肪性肝炎的级联病理进程。研究通过组织学、转录组与蛋白质组学等多维度分析，揭示了TBPH通过激活脂质合成通路、刺激脂滴生成、引发慢性炎症，并最终通过Mfap4信号通路促发肝纤维化的详尽机制，为理解环境污染物在代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）进展中的作用提供了新的见解和潜在干预靶点。
引言：无处不在的新型环境污染物
双(2-乙基己基)-2,3,4,5-四溴邻苯二甲酸酯是一种广泛使用的新型溴化阻燃剂，作为传统多溴二苯醚的替代品，在过去十年中已成为普遍存在的环境污染物，在空气、土壤、沉积物、地表水乃至人体内均有检出。虽然体外研究表明其具有潜在的细胞毒性，但TBPH暴露在体内引起的具体代谢后果，特别是对慢性肝脏疾病的影响，仍不明确。先前在斑马鱼胚胎中的研究表明，急性TBPH暴露会通过促进pparg启动子去甲基化和刺激下游脂质代谢相关基因的转录，导致幼鱼体内脂质储存减少。这种pparg激动剂效应可能与肝脏脂肪变性的起始，或从单纯脂肪肝向如代谢功能障碍相关脂肪性肝病等代谢综合征肝脏表现的转变有关。在全球范围内，MASLD的成人患病率约为30%，已成为一个主要的公共卫生问题。斑马鱼因其发育快速、与人类在脂质代谢通路等方面具有高度遗传保守性，成为研究肝脏发育、再生及脂肪变性病因学的有力模型。
TBPH暴露破坏斑马鱼肝脏稳态
为了探究长期暴露的影响，研究将成年野生型（TU品系）雌性斑马鱼暴露于0微摩尔（对照）、0.02微摩尔（低剂量）或2微摩尔（高剂量）TBPH的环境中，持续6周。暴露结束后，结果发现，与对照组相比，低剂量和高剂量暴露组的斑马鱼体重均显著增加，但肝脏指数却显著降低。在肝脏炎症方面，TBPH暴露诱导了促炎细胞因子IL-1水平的显著升高，且呈现明显的剂量依赖性。TNF-α水平在两个暴露组中也均显著高于对照组。肝脏酶活性评估显示，高剂量组的天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶活性均显著升高，表明出现了明显的肝细胞损伤。
TBPH暴露导致斑马鱼肝脏脂肪变性与纤维化
通过苏木精-伊红染色和马松三色染色对肝脏形态学变化进行评估。HE染色显示，两个暴露组的肝细胞中均出现显著的脂质积聚，脂滴的密度和直径均明显增加。肝脏脂肪变性百分比在低剂量暴露后即显著升高，且在高剂量组中进一步加剧，呈现剂量依赖性。脂滴的平均直径也随暴露剂量增加而增大。马松三色染色进一步证明，低剂量组的胶原沉积（蓝色染色）仍局限于门管区内，而高剂量组的胶原阳性区域已扩展到门管区之外，表明出现了肝纤维化的早期迹象。
TBPH影响斑马鱼肝脏脂质代谢
基因表达分析揭示了TBPH对肝脏脂质代谢网络的广泛扰动。暴露显著上调了肝脏中过氧化物酶体增殖物激活受体家族的两个关键成员pparaa和pparg的表达。其中，pparg的表达呈明显的剂量依赖性增加。脂肪酸结合蛋白11a、乙酰辅酶A羧化酶α、固醇调节元件结合转录因子2以及载脂蛋白A-1a的转录本也均被不同程度地上调。肉碱棕榈酰转移酶1Aa在高剂量组中的表达也显著增加。这些结果表明，TBPH同时激活了肝脏的脂质合成和脂肪酸氧化信号通路。
TBPH在体外刺激脂滴生成
为了在细胞水平验证机制，研究使用了HepG2细胞。免疫荧光成像显示，TBPH暴露以剂量依赖性的方式诱导了HepG2细胞中脂滴的积累。在未处理的对照组中，内质网形态清晰，仅有基础的脂滴形成。低浓度组诱导了内质网附近初始小脂滴的积累。在高TBPH浓度下，脂滴的数量和大小均显著增加，并与内质网有明显的共定位。实时荧光定量PCR分析显示，PPARA、二酰基甘油酰基转移酶2以及细胞死亡诱导DFFA样效应物A的转录水平在TBPH暴露后均呈现显著的剂量依赖性增加。脂滴包被蛋白5在两个暴露组中均上调，而脂滴包被蛋白2的转录水平在低浓度组无变化，但在高浓度组中显著增加。这些结果直接证实，TBPH暴露触发了脂滴的积累和生物生成，且与内质网功能密切相关。
TBPH通过Mfap4信号通路刺激纤维化进程
肝脏蛋白质组学分析揭示了纤维化和脂质代谢紊乱的关键驱动因素。无监督层次聚类分析显示，高、低剂量组的差异表达蛋白具有一致的表达模式，且与对照组明显区分。主成分分析进一步证实了这一点，高剂量组与其他两组分离最远。多元统计分析（偏最小二乘判别分析）鉴定出，与对照组相比，高剂量组中变量重要性投影得分最高的蛋白是微纤维相关蛋白4。Mfap4是肝纤维化的关键驱动因子，其显著上调与高剂量组组织学检查中观察到的肝细胞纤维化变性高度一致。火山图分析进一步表明，Mfap4、线粒体融合蛋白1和黑素转铁蛋白是高剂量组中上调最显著的蛋白。Mfn1是一种位于线粒体外膜的GTP酶，参与线粒体融合过程，其表达升高提示可能存在线粒体功能障碍。此外，KEGG通路富集分析强调，高剂量组与对照组之间的差异表达蛋白在脂质代谢相关通路（如脂肪酸生物合成和亚油酸代谢）中显著富集。这些发现与观察到的肝脏脂质积聚、脂肪变性和纤维化的病理表型相符。
讨论：从脂毒性到纤维化的级联反应
本研究衔接了急性代谢紊乱与慢性肝脏病理学之间的认知空白，揭示慢性TBPH暴露不仅诱导脂肪变性，更会加剧向代谢功能障碍相关脂肪性肝炎和纤维化的转变，其破坏生理稳态的效应远超急性暴露。从单纯脂肪变性到MASH的转变通常由脂毒性和慢性炎症引发。本研究中ALT、AST活性及促炎细胞因子的显著升高证实了TBPH暴露诱导了肝细胞损伤。TBPH暴露同时激活了肝脏脂质合成和氧化信号通路。pparg轴及其下游靶点acaca的上调表明，de novo脂肪生成是主要驱动因素。尽管与脂肪酸氧化和转运相关的基因也被上调，但严重肝脏脂肪变性和脂滴扩张的持续存在表明，TBPH诱导的脂肪生成可能超过了肝细胞的脂质氧化和分泌能力。HepG2细胞的体外实验为这种积累的细胞动力学提供了高分辨率的见解。TBPH暴露以浓度依赖的方式刺激脂滴生物生成，其特征是DGAT2、PLIN2和PLIN5的上调。免疫荧光成像显示，高浓度TBPH暴露诱导了大量增大的脂滴形成，并与内质网共定位。这种内质网-脂滴共定位以及CIDEA的上调促进了脂质转移和脂滴融合，从而推动了大泡性脂肪变性的形成。另一个关键发现是高剂量暴露组出现的肝纤维化。蛋白质组学分析确定Mfap4是高剂量组与对照组之间排名最高的差异表达蛋白。Mfap4是一种位于弹性纤维中的细胞外基质蛋白，已被证明是肝纤维化的关键触发因子。在病理条件下，Mfap4由活化的肝星状细胞分泌，通过自我维持的反馈环促进其运动并增强其抗凋亡能力，从而维持肝星状细胞的活化状态。这种持续激活功能性地映射到经典的纤维化级联反应上，驱动肝星状细胞向表达α-SMA的肌成纤维细胞转分化，最终导致I型胶原和其他结构细胞外基质蛋白的大量沉积。下游NF-κB信号通路的激活不仅通过抗凋亡使纤维化细胞持续存活，还放大了促炎信号，导致胶原沉积和纤维化进展。此外，蛋白质组数据阐明了线粒体重塑的关键作用。Mfn1的上调表明线粒体动力学发生了病理性改变。虽然线粒体融合通常是代谢压力下最大化氧化能力的反应，但在脂质超载的背景下，上调的Mfn1可能促进线粒体与脂滴的拴系。这种接触为参与甘油三酯合成和脂滴扩张的酶提供了ATP支持。同时，线粒体功能障碍诱导的氧化应激可以激活潜在的TGF-β，进一步刺激肝星状细胞，驱动纤维化结果。
结论
综上所述，这些结果定义了TBPH诱导肝毒性的全面不良结局通路。TBPH暴露激活了pparg信号通路，驱动广泛的de novo脂肪生成，超过了肝细胞的适应阈值。这种未解决的脂质负担引发了慢性炎症，并激活了Mfap4信号通路，从而促进肝星状细胞活化和胶原沉积。最终，这一级联反应以肝纤维化进程告终。这些发现强调了TBPH作为一种纤维化刺激物的潜力，对水生生物乃至人类的MASLD进展构成了显著风险。
