《Agronomy》：Sustainable Agricultural Practices for Managing Rice Crops to Minimize Environmental Contamination from the Pesticide Imazamox
Antonio López-Pi?eiro,
Luis Vicente,
Manuel Pérez,
Damián Fernández-Rodríguez and
David Pe?a
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本文综述了利用高通量RNA测序（RNA-Seq）技术，对西班牙商业桃与杏果园中出现的严重病毒病害进行调查。研究成功鉴定出包括高致病性的李痘病毒（Plum pox virus, PPV）Marcus株系（PPV-M）在内的10种病毒，并通过单核苷酸变异（Single Nucleotide Variant, SNV）和系统发育分析，揭示了PPV-M群体的遗传多样性及其与欧洲其他地区毒株的进化关联。文章强调了PPV-M在西班牙的再次出现，凸显了加强植物检疫监控和苗木认证以防止病害通过感染材料交换传播的重要性。
引言
李属（Prunus）植物在全球具有重要的经济价值，其中桃和杏是重要的核果类作物。然而，由李痘病毒（Plum pox virus, PPV，属Potyviridae科）引起的鲨卡病（sharka disease）严重威胁着核果的生产。PPV感染可导致产量减少高达80%，并严重影响果实品质。在西班牙，PPV-M株系自2004年首次发现并根除后，近年来在主要产区再次出现，对桃、杏等作物构成严重威胁。混合病毒感染在自然界中常见，而高通量测序（High-throughput sequencing, HTS）技术，特别是RNA测序，已成为检测和鉴定植物病毒的有力工具。
材料与方法
植物材料与RNA提取
研究从西班牙阿拉贡、加泰罗尼亚和穆尔西亚三个地区的9个商业果园采集了具有典型鲨卡病症状的桃叶片样本，以及1个来自加泰罗尼亚商业农场的杏叶片样本。叶片在RNALater?溶液中保存，在液氮中研磨后，使用NucleoSpin?RNA Plant and Fungi试剂盒提取总RNA。通过凝胶电泳和NanoDropTM One分光光度计评估RNA完整性。最终，选择了5个经特异性RT-PCR验证为PPV-M阳性的样本（ARA1, ARA2, ARA3, CAT1, MUR1）进行RNA-seq分析。
RNA测序文库制备与生物信息学分析
使用QIAseq FastSelect –rRNA Plant Kit去除rRNA，构建了15个（5个样本×3个重复）cDNA文库，在Illumina NovaSeq平台上进行双末端（2 × 150 bp）测序，每个样本平均产生约5200万条原始读长。使用Trimmomatic对原始FASTQ文件进行质量控制，去除接头和低质量序列。然后使用Bowtie2将高质量读长比对到桃和杏的参考基因组，去除宿主序列。将非宿主读长用Trinity进行从头（de novo）组装，生成的contig通过BLASTn与NCBI中已知的李属病毒数据库进行比对，以鉴定病毒。病毒读长覆盖率和深度通过BWA评估。通过针对PPV-M的特异性RT-PCR对RNA-seq结果进行验证。利用SAMtools和BCFtools对PPV-M参考基因组进行单核苷酸变异（SNV）分析。基于检测到的SNV生成样本的一致序列，并与NCBI中公开的PPV不同株系的完整序列一起，使用MEGA12的邻接法构建系统发育树。
结果
病毒鉴定与分布
RNA-seq数据质量高，经过质量控制后保留了约96%的高质量读长。去除宿主序列后，利用非宿主读长进行病毒鉴定。在分析的5个李属样本中，共鉴定出10种不同的病毒，包括李痘病毒Marcus株系（PPV-M）、油菜花叶病毒（Youcai mosaic virus, YoMV）、桃相关黄化病毒（Peach-associated luteovirus, PaLV）等。PPV-M在所有分析的样本中均被检测到，且在大多数样本中表现出极高的基因组覆盖度（>99.5%）和测序深度（>2000×）。除PPV-M外，桃坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus, PNRSV）和桃潜隐花叶类病毒（Peach latent mosaic viroid, PLMVd）也在部分样本中检出。主成分分析（PCA）显示生物学重复结果一致性高。特异性RT-PCR结果确认了样本均感染PPV-M株系，而非Dideron（PPV-D）株系。
李痘病毒（Marcus株系）的单核苷酸变异分析
通过与PPV-M参考基因组（AJ243957.1）比对，在研究的样本中共检测到330个独特的单核苷酸变异（SNV），每个样本平均有173.2个SNV。SNV主要为转换（~85%），其中U?C（平均47.60%）和A?G（平均38.02%）最为常见。在9786个核苷酸的PPV-M基因组中，总体突变率为每100个核苷酸1.77个（1.77%）。不同基因组区域的突变率存在差异，其中NIa-Pro区域平均突变率最高（2.95%），其次是P1-Pro（2.12%）和NIb（1.82%）；而6K2（1.07%）、VPg（1.20%）和CI（1.32%）区域最为保守。
系统发育分析
基于检测到的SNV构建了样本的一致序列，并进行了系统发育分析。第一个系统发育树包含了本研究的样本和其他不同的PPV株系。结果显示，本研究的样本与PPV-M株系聚在一起，其中ARA2、ARA3和CAT1形成一个分支，而ARA1和MUR1形成另一个分支，两者都与PPV-M参考株系亲缘关系密切。第二个系统发育树专门针对PPV-M株系的全球分离物。结果显示，本研究的样本与意大利、罗马尼亚和日本的分离物聚在一个分支内，而ARA1和MUR1与意大利、罗马尼亚、日本的分离物聚类更近，ARA2、ARA3和CAT1则与土耳其的一个分离物更接近。这表明本研究中的PPV-M毒株可能来自不同的传播来源。
讨论
本研究通过RNA-seq工作流程成功筛查并鉴定了西班牙李属果园中的病毒。结果表明，高致病性的PPV-M株系已在西班牙果园中重新出现。除PPV-M外，还检出了其他9种病毒，揭示了果园中病毒群落的复杂性。PPV-M在所有样本中占主导地位，其高测序深度反映了其在寄主中的高复制活性和广泛分布。单核苷酸变异分析显示，PPV-M基因组中SNV以转换为主，且NIa-Pro和P1-Pro区域变异度较高，这些区域与病毒复制、宿主防御反应和致病性相关，其高变异性可能与病毒适应广泛寄主的能力有关。系统发育分析进一步揭示了西班牙PPV-M分离株的遗传多样性，并将其与欧洲其他地区的毒株（如意大利、罗马尼亚、土耳其的分离物）联系起来，表明存在通过感染苗木交换引入的多种途径。这强调了加强植物检疫控制和苗木认证体系，以防止病毒通过植物材料传播的极端重要性。PPV-M的再次出现对西班牙阿拉贡、加泰罗尼亚和穆尔西亚等主要核果产区构成严重的经济威胁，可能导致严重的产量和果实品质损失。因此，必须强化监测计划和认证措施，以限制病毒的传播并最大限度地减少其对核果生产的影响。本研究提供的序列数据和分析结果，为植物病毒学界提供了宝贵的资源，有助于未来对PPV及其他李属病毒的监测、溯源和防控研究。
