开发克鲁氏梭菌遗传系统实现异源n-丁醇与n-己醇生物合成

《Applied and Environmental Microbiology》：Genetic modification of Clostridium kluyveri for heterologous n-butanol and n-hexanol production

这项研究报道了针对模式微生物克鲁氏梭菌(Clostridium kluyveri)的首个遗传操作系统的成功开发。研究者通过鉴定其天然的限制性修饰(Restriction-modification, R-M)系统，并利用关键甲基转移酶模拟宿主DNA甲基化模式，克服了DNA转移的主要障碍。以此为工具，研究实现了从丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)异源表达不同组合的醇脱氢酶基因(adhE2和bdhB)，成功地将该菌的乙醇驱动逆β-氧化(Reverse β-oxidation)途径产物谱扩展到n-丁醇和n-己醇。这项工作不仅为深入探究C. kluyveri的代谢机制和逆β-氧化途径奠定了基础，也为利用该菌从工业废料中可持续生产高价值化学品提供了新策略。

　　

研究背景与目的

中链羧酸盐(MCCs)是化妆品、药品、香料等多个行业不可或缺的化学品，其传统生产依赖于化石资源或动植物油脂，带来环境与资源压力。微生物链延长，特别是利用克鲁氏梭菌(Clostridium kluyveri)进行的乙醇驱动逆β-氧化途径，是生产MCCs的一种可持续生物技术方案。C. kluyveri 是该领域的模式微生物，但长期以来缺乏有效的遗传操作系统，极大限制了对其代谢的深入研究和工程化改造。本研究的核心目标是开发适用于 C. kluyveri 的通用遗传工具，并以此为基础，拓展其产品谱，实现高价值化学品n-丁醇和n-己醇的异源生产。

优化培养与筛选条件

成功的遗传操作始于可靠的培养方法。研究人员首先系统优化了 C. kluyveri 的平板培养条件，以高效获得单菌落。结果表明，在基础DSMZ52培养基中补充10倍浓度的维生素，并使用处于指数生长早期的细胞，能最显著地提高菌落形成效率。采用倾注平板法、增加培养罐气压以及在培养皿盖内放置浸有乙醇的无菌滤纸以确保底物供应，也显示出一定的积极效果。相反，使用复杂的改良强化梭菌培养基(RCM)或在平板外部气氛中添加乙醇则会降低效率。最终确定的常规平板培养条件，获得了约77.2% ± 14.1%的铺板效率。此外，研究测定了野生型菌株对硫姆霉素的最小抑制浓度(MIC)为3 μg/mL，为确保筛选阳性转化子，后续实验采用了5 μg/mL的工作浓度。

攻克DNA转移的天然屏障：限制性修饰系统

尝试将常用的梭菌穿梭载体质粒pMTL83151导入 C. kluyveri 的初期努力受挫。利用 C. kluyveri 细胞裂解液进行的限制性实验表明，其天然的限制性修饰系统是外源DNA转移的关键屏障。PacBio测序分析揭示了其基因组DNA存在GATC、GWTAAT、CCAAG、CAAAAAT和CCGG等多个甲基化位点。通过计算机模拟分析，确认质粒pMTL83151上未甲基化的CCGG位点是限制性内切酶攻击的关键靶点。

为了突破这一屏障，研究人员从REBASE数据库中鉴定出 C. kluyveri 基因组中编码甲基化CCGG位点的关键甲基转移酶(基因座标签CKL_2671)。他们构建了质粒pMeth，在该质粒上，此甲基转移酶基因受异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的P_lac启动子控制。通过在携带穿梭质粒pMTL83151的大肠杆菌(E. coli)中共同表达pMeth，实现了对穿梭质粒的 C. kluyveri 特异性甲基化模拟。优化IPTG诱导浓度(最终确定为500 μM)后，甲基化的质粒在 C. kluyveri 裂解液中的酶切消化被显著抑制，表明外源DNA因获得与宿主相同的甲基化模式而受到保护。

建立三亲本接合转移系统

由于共携带pMeth和穿梭质粒的大肠杆菌TOP10菌株生长受到抑制，研究人员采用了改进的三亲本接合策略进行DNA转移。其中，携带甲基化穿梭质粒的 E. coli TOP10 作为供体菌，携带辅助质粒pRK2013的 E. coli HB101 作为辅助菌，C. kluyveri 野生型作为受体菌。为了在同一个平板上支持 E. coli 和 C. kluyveri 的共同生长，测试了不同乙醇浓度的RCM培养基，最终选择使用257 mM乙醇进行接合培养。评估不同接合时间(24至120小时)后发现，24小时后即可在含有硫姆霉素和甲氧苄啶的筛选平板上观察到单菌落，延长至48-72小时可获得更多菌落形成单位(CFU)。通过菌落PCR和16S rRNA基因测序，成功验证了穿梭质粒已稳定存在于纯培养的 C. kluyveri 细胞中。

异源基因表达的概念验证：拓展产物谱

在成功建立遗传系统后，研究选择了不干扰 C. kluyveri 核心能量代谢(逆β-氧化)的策略，通过引入外源基因来扩展其产物谱。具体目标是实现从丁酰辅酶A(butyryl-CoA)和己酰辅酶A(hexanoyl-CoA)到n-丁醇和n-己醇的转化。为此，他们将来自丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum)的 adhE2 基因(编码双功能醇脱氢酶AdhE2)克隆到穿梭质粒pMTL83151上。AdhE2可催化酰基辅酶A到相应醛，再到醇的两步还原反应。转入该质粒的 C. kluyveri 工程菌株(C. kluyveri pPadhE2_adhE2)成功生产出了n-丁醇和n-己醇，但产量较低。

为了提高产量，研究从两个方面进行了优化：一是使用更强的启动子增强表达；二是引入使用不同辅因子的酶以优化细胞内氧化还原平衡。首先，用据报道更强的来自 C. acetobutylicum 的P_thl启动子替换 adhE2 自身的P_adhE2启动子，构建了 C. kluyveri pPthl_adhE2 菌株，其醇产量有所提升。其次，考虑到AdhE2使用NADH，可能过度消耗细胞内NADH库，他们引入了同样来自 C. acetobutylicum 的 bdhB 基因，其编码的丁醇脱氢酶B(BdhB)专门催化醛到醇的第二步反应，并使用NADPH作为辅因子。他们构建了共表达 adhE2 和 bdhB 的菌株 C. kluyveri pPthl_adhE2_bdhB。值得注意的是，含有较大质粒(8.234 kbp)的 pPthl_adhE2_bdhB 成功转入 C. kluyveri 需要长达72小时的接合时间。

工程菌株的生长与醇生产能力评估

在分批培养实验中，研究人员评估了不同工程菌株的表现。携带空载体的阴性对照、C. kluyveri pPadhE2_adhE2 和 C. kluyveri pPthl_adhE2_bdhB 菌株生长情况相似，倍增时间在4.5至8小时之间。而 C. kluyveri pPthl_adhE2 菌株的三个生物学重复则表现出延迟且不一致的生长起始，导致较大的标准偏差。后续分析发现，在三次独立实验中，有两次该菌株完全丧失了产醇能力，并且在成功产醇的那次实验中也检测到其P_thl启动子区域存在部分突变。这表明仅用强启动子P_thl驱动 adhE2 高表达可能对细胞造成压力(可能源于有毒醛中间体的积累)，从而产生了抑制其表达的选择压力。

600, showing that all strains but C. kluyveri pPthl_adhE2 showed comparable growth. (B) C. kluyveri pPthl_adhE2_bdhB reached the highest n-butanol concentration, whereas C. kluyveri pPadhE2_adhE2 and C. kluyveri pPthl_adhE2 showed comparable production levels. (C) We observed the highest n-hexanol levels for C. kluyveri pPthl_adhE2_bdhB, followed by C. kluyveri pPthl_adhE2.">

在醇产量方面，C. kluyveri pPthl_adhE2_bdhB 表现最佳，达到了最高的n-丁醇(4.0 ± 0.3 mM)和n-己醇(3.9 ± 0.6 mM)产量。其次是 C. kluyveri pPthl_adhE2 (n-丁醇: 2.0 ± 0.3 mM; n-己醇: 2.3 ± 0.1 mM) 和 C. kluyveri pPadhE2_adhE2 (n-丁醇: 2.2 ± 0.3 mM; n-己醇: 2.2 ± 0.3 mM)。共表达BdhB不仅提高了产量，还稳定了菌株表型，避免了启动子突变，这可能是因为BdhB加速了醛向醇的转化，缓解了醛积累带来的毒性。

在代谢物分析中，一个有趣的现象是，产醇能力最强的 C. kluyveri pPthl_adhE2_bdhB 菌株，其最终生物量(OD₆₀₀)最高，但产生的n-己酸(n-caproate)浓度却比其它菌株和阴性对照低约22-30%。同时，该菌株在实验结束时的乙醇/乙酸消耗比也最低。研究人员推测，这可能是由于AdhE2(使用NADH)和BdhB(使用NADPH)的协同作用，更平衡地利用了NADH和NADPH两种辅因子，避免了NADH的过度消耗，从而维持了更有利的NADH/NAD⁺氧化还原平衡。这种平衡的辅因子利用可能支持了更高的醇合成通量，但部分分流了原本用于合成n-己酸的NADH，导致了羧酸盐产量的下降。

结论与展望

本研究成功开发了首个用于模式链延长微生物克鲁氏梭菌(C. kluyveri)的遗传操作系统。其核心突破在于鉴定并利用宿主的关键甲基转移酶，通过模拟其天然DNA甲基化模式，巧妙绕过了限制性修饰系统的防御，实现了外源质粒的稳定导入。作为概念验证，研究通过异源表达来自丙酮丁醇梭菌的醇脱氢酶基因(adhE2 和 bdhB)，成功地将 C. kluyveri 的产物谱从羧酸盐扩展到了更高价值的醇类(n-丁醇和n-己醇)。优化策略(使用强启动子、引入NADPH依赖型脱氢酶)有效提升了产量，并揭示了辅因子平衡在代谢工程中的重要性。这项工作为在C. kluyveri中应用更先进的基因编辑技术(如同源重组、CRISPR系统)铺平了道路，从而能够更深入地研究逆β-氧化途径的机理，并通过代谢工程改造进一步提高其生产性能、拓展产品范围，最终推动基于微生物链延长技术的可持续化学生产走向实际应用。