综述：堆肥过程中腐殖化过程的驱动力量：从微生物视角分析

《Applied and Environmental Microbiology》：Driving forces of the humification process in composting: from a microbial perspective

本文系统梳理了堆肥系统中微生物代谢与腐殖化过程的内在联系。综述指出，腐殖化是决定堆肥品质的关键，其核心在于小分子前体聚合成腐殖质（HS）。微生物代谢通过胞外酶（如水解酶、氧化还原酶）分解有机质，生成前体并调控微环境，为功能基团聚合反应和自由基氧化偶联提供了物质与能量基础。同时，胞内代谢（如糖酵解、三羧酸循环、氨基酸代谢、磷酸戊糖途径、莽草酸途径等）产生的中间代谢物和能量（ATP），不仅为腐殖质前体（如芳香族氨基酸、酚类化合物）的生物合成提供原料，其产生的生物热和pH变化也为聚合反应创造了有利条件。本文为理解腐殖化的微生物驱动机制提供了全面的理论框架，并为优化堆肥工艺以促进有机废弃物资源化提供了新思路。

　　

堆肥是一个低成本、无害且可大规模应用的有机废弃物处理技术，其最终产物的质量对于农业应用至关重要，而腐殖质（HS）的含量是衡量堆肥品质的关键指标。有机物料转化为腐殖质的过程被称为腐殖化，其核心是微生物将降解产生的小分子化合物（前体）通过复杂的聚合反应形成结构稳定的腐殖质。这一过程与微生物的代谢活动密不可分，本文旨在从微生物视角，深入剖析驱动腐殖化进程的具体机制。

腐殖化过程中的聚合理论

在堆肥中，腐殖化过程与生物化学过程紧密相连，实质上是小分子化合物聚合形成腐殖质。目前，基于腐殖质前体的不同分子结构和功能基团，主要有四种腐殖化理论：木质素-蛋白质理论、多酚自缩合、多酚-蛋白质途径以及美拉德反应。这些理论涉及两种主要反应类型：功能基团聚合反应和自由基氧化偶联。

功能基团聚合反应涵盖了氨基（–NH₂）和羰基（–C=O）反应形成亚胺（C=N）和肟（O–NH₂）等席夫碱和阿马多里产物的过程，以及羟基（C–OH）与羧基（–COOH）之间形成醚键（C–O–C）和酯键（–COOC）的反应。新生成的产物具有活性基团，其杂环原子（N， O）的电子云密度较高，能通过氢键和π-π电子堆叠与蛋白质、木质素残基持续结合，形成低分子量聚合物，并逐步聚合。

另一种聚合涉及自由基氧化偶联，主要发生在酚类化合物的转化过程中，例如酚类化合物转化为持久性自由基（PFRs），如苯氧自由基和半醌自由基。随后，PFRs中不稳定的电子转移至具有更高氧化还原电位的电子受体。失去电子的PFRs易于与含氮或其他底物发生偶联反应，形成腐殖质的核心骨架。

微生物代谢与腐殖化过程的关系

微生物的代谢活动利用多种酶获取可利用物质并同时转化这些物质，进而通过改变微环境影响物质的非生物转化。这些代谢活动涉及大量具体的代谢过程，与腐殖化如何关联需要系统探索。根据代谢过程发生的位置，微生物代谢主要分为胞外代谢和胞内代谢两大部分。

胞外代谢在腐殖化过程中的作用

胞外代谢主要通过胞外酶的作用参与大分子化合物的生物降解。这些多样化的酶能够通过氧化反应、水解和脱羧作用将复杂的有机化合物分解为小分子和其他残基。产生的小分子包括长链脂肪酸、氨基酸、还原糖、单糖和芳香族化合物，它们具有氨基、羰基和芳香基等活性功能基团，能够直接参与功能基团聚合反应。此外，具有还原性功能基团的物质通过胞外代谢进一步转化，产生活性中间体，并触发氧化偶联聚合反应。

胞外酶主要分为水解酶和氧化还原酶两类。水解酶通过水解反应切断底物中的特定化学键，将复杂化合物转化为简单物质。研究表明，水解酶的活性及其相关功能基因的变化与最终堆肥产品中腐殖质的形成显著相关。相反，氧化还原酶通过涉及产生活性中间体（如PFRs和活性氧ROS）的机制，促进顽固物质的降解并进一步驱动产物的转化。这种能力使得氧化还原酶能够更有效地降解材料，从木质纤维素中释放芳香族化合物，并影响酚类组分的后续转化，从而为腐殖质形成提供更多的聚合位点。

水解酶对聚合的影响

水解酶主要通过水解堆肥中的木质纤维素和蛋白质，为聚合反应提供前体。纤维素水解酶（如内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶）和半纤维素水解酶（如内切木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶等）能将多糖分解为寡糖和单糖。蛋白酶将蛋白质水解为肽和氨基酸。这些水解产物包含多种单糖和氨基酸，由于其活性功能基团（羰基和氨基）能够直接参与聚合反应，形成复杂的聚合结构。

氧化还原酶对聚合反应的影响

与水解酶相比，氧化还原酶具有独特的氧化还原能力，在前体的生成和转化中发挥关键作用，为后续复杂的聚合反应奠定了基础。这种能力源于酶介导的电子转移机制。根据最终电子受体的不同，氧化还原酶可分为利用O₂的酶（如漆酶Lac、裂解性多糖单加氧酶LPMO）和利用H₂O₂的酶（如木质素过氧化物酶LiP、锰过氧化物酶MnP）。后者氧化能力更强。

氧化还原酶可以通过直接和间接方式降解木质素和纤维素。在间接降解中，无论氧气还是过氧化氢作为电子受体，氧化还原酶都有可能通过单电子转移诱导产生活性中间体，包括ROS（•OH， ^•O₂^?， H₂O₂）和PFRs。ROS可以断裂大分子物质的化学键，释放出多酚、木质素残基和多糖等前体。在直接降解中，氧化还原酶可以从木质纤维素的醚键、C_α–C_β键和烷基键获取电子，然后插入氧原子，产生更多含氧功能基团，如羟基、羧基和羰基。这些生成的物质可以作为前体，通过功能基团聚合形成腐殖质。

除了功能基团聚合，自由基氧化偶联是由酚类化合物引发的另一种聚合反应。这归因于氧化还原酶对酚类组分的进一步转化，其可以从酚类化合物中提取电子传递给最终电子受体，导致产生活性自由基中间体，如苯氧自由基和半醌自由基。半醌自由基是一种更稳定的化合物，可以与其他含氮物质和芳香物质发生氧化偶联。同时，这一过程在与ROS生成相关的氧化还原循环中也起着重要作用。酚-醌循环促进了ROS的生成，赋予了该过程显著的氧化能力。这种氧化能力不仅加速了更多还原性物质的进一步转化，还诱导其持续参与聚合反应，最终形成高分子量的氧化偶联产物。

胞内代谢在腐殖化过程中的作用

随着堆肥过程的进行，各种小分子物质（也称为初级代谢物）从大分子物质中释放出来。微生物通常通过胞内代谢利用这些物质来支持其生长和活动。这种代谢涉及能量和次级代谢物的产生，通常会导致堆肥微环境和组成的变化。值得注意的是，聚合反应仍然经常与这些代谢过程同时发生。

基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库的胞内代谢过程分析表明，碳水化合物、氨基酸、外源物和脂质的代谢对于腐殖化至关重要。其中已确认影响腐殖质形成的具体KEGG三级通路包括：（i）碳水化合物代谢中的糖酵解途径（GP）、磷酸戊糖途径（PPP）和三羧酸循环（TCA）；（ii）氨基酸代谢中的色氨酸代谢和酪氨酸代谢；（iii）外源物代谢中的双酚代谢和醌生物合成；以及（iv）脂质代谢中的脂肪酸降解。这些通路涉及分解代谢和合成代谢。

分解代谢如何影响聚合反应？

分解代谢通常与能量代谢和代谢中间体的生成相关，这一过程会诱导堆肥过程中环境条件和物质组成的变化。因此推测，分解代谢可以通过分解糖类、氨基酸和脂肪酸等小分子物质，直接或间接地影响聚合反应。在分解代谢过程中，小分子物质通过特定代谢途径转化为丙酮酸和乙酰辅酶A，随后进入三羧酸（TCA）循环，最终产生三磷酸腺苷（ATP）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）。糖类的转化通常涉及GP和PPP，通过相关关键酶发生脱羧和氧化还原反应，形成酮、短链羧酸和醇。氨基酸代谢通过各种降解途径发生脱氨基和脱羧反应，产生有机酸和酰胺等中间体。同样，脂肪酸可通过脱羧转化为甘油和短链脂肪酸。这些中间产物具有羟基、羰基和羧基等活性功能基团，使其具备参与功能基团聚合反应的潜力。同时，被确定为典型代谢中间体的酰胺是活性物质，可以提供额外的结合位点以增强聚合过程并增加聚合物的分子量。

此外，微生物代谢引起的温度和pH变化可能增加物质间发生聚合反应的可能性。分解代谢的基本能量产生在于化合物的氧化还原反应，这一过程伴随着显著的热效应。特别是TCA循环作为核心代谢途径，在提高堆肥系统温度方面起着关键作用，其释放的热量为后续聚合反应提供了必要的活化能量。同样，脱氨基反应将氨基释放到环境中，可导致堆肥pH值升高。碱性条件有利于腐殖化中的聚合反应。在碱和氧存在下，碳水化合物和有机酸会发生脱羧，导致芳烃的生成。这些芳烃随后与富氧聚合中间体发生结构交联，从而增加聚合物的分子量，并有助于形成类腐殖质超分子结构。

分解代谢中氧化磷酸化过程的作用

氧化磷酸化作为能量代谢的关键过程，是分解代谢中的核心电子传递途径。电子传递过程可根据最终电子受体在细胞内或外，分为胞内和胞外过程。胞外电子传递（EET）涉及电子跨细胞膜转移到胞外电子受体（如氧气、铁或腐殖质）的过程。从机制上讲，胞外受体在接收电子后，通过与电子传递链直接或间接相互作用被还原。这种还原诱导了关键活性中间体、ROS和PFRs的生成，这些中间体在促进前体的转化和生成中起着关键作用。

尽管缺乏确凿证据证明EET在堆肥过程中对腐殖化有直接影响，但堆肥系统固有的好氧-厌氧混合条件表明EET过程客观上会发生。在此背景下，已研究了EET功能微生物与腐殖化之间的潜在关系。已证实，在堆肥中添加铁矿物不仅可以建立芬顿或类芬顿反应，还有利于铁还原菌（EET功能，如芽孢杆菌属、地芽孢杆菌属、铁杆菌属等）的富集，驱动铁循环并诱导ROS和PFRs的生成。这显著提高了有机物氧化速率和碳转化效率，从而有效促进了腐殖化过程。类似地，电场辅助堆肥也能增强电子传递效率，显著增加电活性细菌的丰度。因此，EET功能微生物的增强进一步促进了活性中间体的形成，对腐殖化过程施加了显著的驱动力。

合成代谢如何影响聚合反应？

作为整合分解代谢产生的中间代谢产物的关键环节，合成代谢通过将这些中间体转化为生物分子，为后续聚合反应提供物质基础，从而在腐殖化过程中发挥重要作用。氨基酸和芳香族化合物（包括芳香族氨基酸、酚类和醌类化合物）的生物合成尤为重要，因为这些化合物在腐殖化过程中常作为聚合反应的前体。

氨同化具有明确的代谢途径和固氮机制，已成为堆肥研究中探讨氨基酸合成代谢与腐殖化关系的代表性途径。该途径通过谷氨酸脱氢酶（GDH）和谷氨酰胺合成酶（GOGAT）途径将NH₄⁺-N转化为有机氮（谷氨酰胺和谷氨酸）。在生物强化机械堆肥中，氨同化能力通过有机酸积累和随之而来的pH降低而得到显著改善。因此，在BMC系统中，参与GDH和GS-GOGAT途径的关键酶活性上调，并伴随着相关调控基因表达的增加。这些变化共同增强了氨基酸的生物合成，并最终促进了腐殖质的形成。

芳香族氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，具有芳香环和多样的功能基团，能够诱导更复杂的聚合反应。莽草酸途径（SAP）是芳香族氨基酸生物合成的关键代谢途径，被广泛用于堆肥研究以阐明微生物代谢与腐殖化之间的内在联系。该途径利用分解代谢产生的中间代谢物，如赤藓糖-4-磷酸（E4P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），作为前体，通过一系列酶促反应合成芳香族氨基酸。关键酶包括3-脱氧-7-磷酸庚酮糖异构酶、脱氢奎尼酸脱水酶和莽草酸脱氢酶。在促进腐殖化的各种调控策略下，这些关键酶编码基因的表达水平显著上调。这种现象与微生物缓解由胞外氧化还原波动引起的氧化损伤的策略有关。研究表明，当胞外氧化还原波动引发微生物氧化应激时，微生物通常会上调PPP，生成PEP和E4P等重要代谢中间体。这些中间体进一步进入SAP，最终导致芳香族化合物的合成，从而帮助微生物缓解氧化损伤并维持细胞内氧化还原平衡。

除了芳香族氨基酸，SAP的一个主要分支可以合成胞内酚类芳香族化合物，如儿茶酚和没食子酸。这些酚类化合物直接参与功能基团聚合反应，并通过涉及酚-醌转化的氧化还原循环促进氧化偶联聚合。腐殖化过程与酚类和醌类生物合成途径之间的强相关性已通过堆肥中的KEGG数据库和NIST标准得到揭示。这些发现强调了合成代谢过程中芳香族化合物的生物合成对腐殖化过程的直接影响。

总结

总而言之，一方面，分解代谢涉及将碳源分解为具有活性功能基团和结合位点的中间代谢产物，这些是胞外聚合反应的关键前体。这一过程不仅显著改变了胞外环境的理化性质（如pH），还释放能量和热量，为胞外聚合反应提供了所需的活化能。此外，分解代谢过程中的氧化磷酸化驱动胞外氧化还原反应，实现前体物质的化学转化，并促进更复杂的聚合反应。另一方面，合成代谢整合了分解代谢产生的一部分中间体，合成大分子或功能分子，从而为腐殖化过程提供了必要的物质基础。