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本文开发了新型抗人Cadherin-19 (CDH19) 单克隆抗体Ca19Mab-8。该抗体在流式细胞术中对细胞表面CDH19展示出高特异性与中等亲和力(KD= 9.0 × 10?9M)，并成功应用于免疫印迹 (Western blotting, WB) 和免疫组化 (IHC)，为靶向神经嵴相关肿瘤（如恶性黑色素瘤和胶质母细胞瘤）的基础研究与诊疗开发提供了关键工具。
1. 引言
Cadherin-19 (CDH19) 是一种神经嵴特异性的粘附分子，在维持大脑稳态中发挥核心作用。它属于经典II型钙粘蛋白家族，具有五个胞外钙粘蛋白重复结构域 (EC1–EC5)、一个单次跨膜区和一个胞质尾部。CDH19的胞外域在粘附连接处介导钙依赖性同型相互作用，其胞质域与α-连环蛋白、β-连环蛋白和p120连环蛋白结合，从而将CDH19连接到肌动蛋白细胞骨架。人类CDH19基因于2000年基于与CDH7的序列相似性被克隆。研究表明，CDH19表达可能局限于神经嵴来源的细胞。在早期神经嵴细胞迁移过程中，CDH19通过形成CDH19-连环蛋白-细胞骨架复合体发挥作用，这对于神经嵴细胞的发育至关重要，并为了解神经系统发育缺陷的发病机制提供了线索。
恶性黑色素瘤是一种由来源于神经嵴的黑色素细胞癌变引起的皮肤癌。尽管免疫检查点抑制剂已成为晚期黑色素瘤患者的标准治疗，但它仍是美国皮肤疾病死亡的主要原因。单细胞多组学分析显示，人类黑色素瘤细胞可分为七种亚型，其中包括一种高表达CDH19的亚型，该亚型被认为对NK细胞和T细胞介导的免疫更具抵抗力。
目前已有数种可用于免疫印迹或免疫组化的抗CDH19单克隆抗体 (mAbs)，但其中一些识别的是CDH19的胞内结构域。能够靶向胞外结构域并适用于流式细胞术的抗CDH19单克隆抗体，对于开发治疗性抗体尤为重要。然而，此前尚无适用于流式细胞术的抗CDH19单克隆抗体。本研究旨在利用基于细胞免疫与筛选的方法，开发具有高通用性的抗CDH19单克隆抗体。
2. 材料与方法
研究人员利用稳定过表达人CDH19的中国仓鼠卵巢K1细胞和人胶质母细胞瘤LN229细胞系作为免疫原和筛选/验证工具。通过基于细胞免疫与筛选的高通量流式细胞术筛选，获得了杂交瘤细胞。通过有限稀释法克隆了产生抗CDH19单克隆抗体的杂交瘤细胞株，最终获得了12个克隆。其中，克隆Ca19Mab-8 (IgG1, κ) 被用于深入研究。通过流式细胞术评估了其特异性、结合能力与亲和力，并通过免疫印迹和免疫组化验证了其在多种应用场景下的有效性。
3. 结果
3.1. 基于CBIS方法的抗CDH19单克隆抗体开发
使用稳定过表达CDH19的LN229细胞免疫小鼠，经细胞融合和筛选，最终从958个杂交瘤孔中获得了43个阳性孔 (4.5%)，并最终建立了12个能产生抗CDH19单克隆抗体的杂交瘤克隆。Ca19Mab-8是其中一个被成功纯化的单克隆抗体 (IgG1亚型)。
3.2. 利用过表达CDH的CHO-K1细胞确定Ca19Mab-8的特异性
为了评估Ca19Mab-8的特异性，研究人员测试了其与一系列在CHO-K1细胞中过表达的I型、II型、7D型、截短型和非典型钙粘蛋白的反应性。流式细胞术结果显示，Ca19Mab-8特异性识别过表达CDH19的CHO-K1细胞，而不与包括CDH7在内的其他21种钙粘蛋白发生交叉反应。相比之下，其他Ca19Mabs则表现出对其他II型钙粘蛋白的交叉反应性。这表明Ca19Mab-8是针对CDH19的高度特异性抗体。19Mab-8 in CDH-overexpressed CHO-K1 cells.">
3.3. Ca19Mab-8对过表达CDH19的CHO-K1和LN229细胞的流式细胞术分析
Ca19Mab-8能以剂量依赖的方式识别过表达CDH19的CHO-K1细胞，浓度为10 μg/mL时不识别亲本CHO-K1细胞。同样，它能以剂量依赖的方式识别过表达CDH19的LN229细胞，并且也能识别亲本LN229细胞，表明LN229细胞表达内源性的CDH19。通过流式细胞术测定的结合亲和力显示，Ca19Mab-8与LN229/CDH19细胞的解离常数 (KD) 为9.0 × 10?9M，表明其具有中等结合亲和力。19Mab-8.">
3.4. 使用Ca19Mab-8进行免疫印迹分析
免疫印迹实验表明，Ca19Mab-8在CHO/CDH19和LN229/CDH19细胞的裂解物中，能在90-100 kDa附近检测到清晰的条带，而在亲本CHO-K1细胞中则没有。在亲本LN229细胞中也能检测到条带，其强度约为LN229/CDH19细胞的1/20。这证明Ca19Mab-8能够通过免疫印迹检测外源性和内源性的CDH19。19Mab-8.">
3.5. 在福尔马林固定石蜡包埋细胞块中使用Ca19Mab-8进行免疫组化
在CHO/CDH19和CHO-K1细胞的福尔马林固定石蜡包埋切片上进行免疫组化染色。结果显示，Ca19Mab-8在CHO/CDH19细胞中显示出强烈的细胞质和细胞膜染色，而在CHO-K1细胞中则没有。这表明Ca19Mab-8可用于培养细胞的福尔马林固定石蜡包埋切片的免疫组化检测。19Mab-8 in formalin-fixed paraffin-embedded cell blocks.">
3.6. 在福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织中使用Ca19Mab-8进行免疫组化
研究人员使用胶质母细胞瘤和恶性黑色素瘤组织芯片进行了免疫组化分析。Ca19Mab-8在一个直肠恶性黑色素瘤病例 (ME241a组织芯片，10例中的1例) 中显示出细胞膜染色，而同型对照抗体则没有。在另一个包含12例的恶性黑色素瘤组织芯片 (ME242b) 和一个包含40例的胶质母细胞瘤组织芯片中，未发现CDH19阳性病例。这些结果表明，Ca19Mab-8适用于通过免疫组化检测福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织中的内源性CDH19。19Mab-8 in the melanoma tissue array.">
4. 讨论
本研究利用基于细胞免疫与筛选的方法鉴定出了新型抗CDH19单克隆抗体。其中，Ca19Mab-8在流式细胞术和免疫印迹中均能识别外源性和内源性CDH19。该抗体特异性结合CDH19，不与其他I型、II型、7D型、截短型或非典型钙粘蛋白发生交叉反应。而其他九种Ca19Mabs则在流式细胞术中显示出与CDH7等其他II型钙粘蛋白的交叉反应性。由于大多数市售抗体缺乏交叉反应性信息，因此在使用时需要谨慎处理和解读。确定Ca19Mab-8的表位对于开发更特异的抗CDH19抗体至关重要。此外，Ca19Mab-8适用于细胞块和组织芯片的免疫组化分析，并且该免疫组化是使用全自动玻片染色系统完成的，这为肿瘤诊断提供了标准化的染色条件。因此，Ca19Mab-8是一种在基础研究和临床应用方面都具有高度通用性的工具。
研究证明，Ca19Mab-8能在流式细胞术和免疫印迹中识别人胶质母细胞瘤LN229细胞。尽管在其他胶质母细胞瘤细胞系中检测了Ca19Mab-8的反应性，但LN229是目前唯一被Ca19Mab-8识别出的细胞系。由于LN229中CDH19的表达水平不高，这限制了其在体内研究中的应用。因此，在未来研究中寻找CDH19过表达的癌细胞系至关重要。先前研究已在从新鲜胶质母细胞瘤样本中分离出的胶质母细胞瘤干细胞样细胞中检测到CDH19。未来应研究Ca19Mab-8与这些样本的反应性，并评估其抗肿瘤功效。研究团队已克隆了Ca19Mab-8的cDNA，将生产重组小鼠IgG2a型抗体以赋予抗体依赖性细胞毒性，并在小鼠胶质母细胞瘤异种移植模型中评估其抗肿瘤活性。
转移性黑色素瘤仍然是一个重大的临床挑战。尽管免疫检查点抑制剂的应用已显著改善了治疗效果，但约一半的转移性黑色素瘤患者无法获得长期生存获益。最近的一项单细胞和空间多组学分析表明，未经治疗的黑色素瘤活检组织中存在处于间充质样状态的癌细胞。处于间充质样状态的黑色素瘤细胞表现出对靶向治疗和免疫治疗的抵抗，并且更常见于对治疗无反应的病灶中。
Ca19Mab-8在一个直肠恶性黑色素瘤病例中显示出CDH19的细胞膜染色。最近，CDH19被鉴定为受主转录因子TCF4调控的间充质样状态标志物。从遗传学上靶向TCF4可增强免疫原性，并提高间充质样状态细胞对免疫治疗和靶向治疗的敏感性。因此，CDH19是靶向处于耐药间充质样状态的黑色素瘤细胞的一个有前景的抗原。此外，一项专利报告指出，CDH19在黑色素瘤细胞系 (如CHL-1) 中表达，该细胞系可作为黑色素瘤治疗的临床前模型。由于Ca19Mab-8能够通过流式细胞术和免疫组化检测CDH19阳性细胞，且无交叉反应性，因此它可为开发包括抗体药物偶联物、双特异性抗体和嵌合抗原受体T细胞在内的多种治疗模式奠定关键基础。当然，抗体内化和表位可及性等额外验证对于其治疗应用至关重要。
