美国首次对双斑棉叶蝉（Amrasca biguttula，半翅目：叶蝉科）进行分子鉴定 作者：赵朝阳（Chaoyang Zhao）和基普林·S·巴尔科姆（Kipling S. Balkcom）

两斑棉叶蝉在美国阿拉巴马州棉田首次通过COI基因测序获得分子确认，采集标本包括若虫和成虫，序列与亚洲已知样本高度匹配（>99%），并构建系统发育树证实归属。该研究为入侵监测和防治提供可靠分子依据。

　　

简单概述

双斑棉叶蝉（Amrasca biguttula）是一种有害昆虫，会在亚洲和非洲的棉花及其他作物上造成严重的产量损失。这种原产于亚洲的物种最近根据形态特征在西半球被报道发现，但其在美国的存在尚未通过DNA方法得到确认。在这项研究中，我们在美国阿拉巴马州梅肯县的一个棉花田中观察到了A. biguttula的活动，收集了多个生命周期阶段的标本，并通过DNA条形码技术确认了其身份。这些结果代表了A. biguttula在美国的首次分子确认。准确的鉴定至关重要，因为该物种与其他叶蝉在幼虫阶段非常相似。我们的发现为美国棉花生产系统的监测和管理工作提供了可靠的遗传参考。

摘要

本报告记录了双斑棉叶蝉（Amrasca biguttula (Ishida) (半翅目：Cicadellidae) 在美国的首次分子证据。2025年8月，我们在阿拉巴马州梅肯县的一个棉花（Gossypium hirsutum）田中收集了多个龄期的若虫和成虫标本。虽然成虫的前翅上观察到了明显的成对暗斑，但若虫的翅基部并未始终表现出这一特征。细胞色素氧化酶I (COI) DNA条形码技术确认了标本的身份。美国样本与亚洲的A. biguttula参考序列的相似度超过99%，系统发育分析以100%的后验概率支持将其归入A. biguttula分支。尽管该害虫早在2023年就基于形态特征在波多黎各被报道过，但我们的发现提供了其在美国的第一个DNA确认证据。鉴于该害虫在亚洲和非洲对棉花的破坏作用，本报告强调了在美国棉花种植区进行监测和制定管理策略的紧迫性。

1. 引言

双斑棉叶蝉（Amrasca biguttula (Ishida)，也被称为棉蚜或印度棉叶蝉，是一种重要的害虫，以多种宿主为食，尤其偏好锦葵科作物，如棉花（Gossypium属）和秋葵（Abelmoschus esculentus）[1]。若虫和成虫都会吸取叶片汁液并分泌唾液毒素，导致“叶蝉灼伤”症状，表现为叶片黄化、坏死斑点、卷曲，最终落叶。严重感染可使棉花产量损失超过60%，秋葵损失超过50%[2,3]。

这种原产于亚洲的物种于2023年首次在西半球被报道，依据的是在波多黎各收集的标本的形态学鉴定[4]。2024年和2025年，推广公告和害虫警报报告了A. biguttula在佛罗里达州、乔治亚州、南卡罗来纳州和阿拉巴马州的出现，提醒种植者和研究人员注意这一潜在威胁。然而，这些报告仅基于形态学鉴定，此前尚未通过分子技术确认其在美国的存在。

由于A. biguttula在幼虫阶段与其他Empoascini叶蝉非常相似，因此分子诊断对于准确鉴定物种至关重要。在这项研究中，我们从疑似受到A. biguttula侵染的棉花田中收集了标本，并使用基于DNA的方法确认了其身份。这项工作为未来的诊断和监测工作提供了可靠的分子参考。

2. 材料与方法

2.1. 昆虫采集

2025年8月，在阿拉巴马州梅肯县奥本大学E.V. Smith研究中心的一个棉花（G. hirsutum）田中观察到了“叶蝉灼伤”症状（坐标：32.420922° N, 85.887618° W）。检查了田边10多株有症状的植物，从几株植物的上部三分之一区域收集了含有不同生命周期阶段若虫和成虫的叶片，并将其放入塑料密封袋中运送到实验室。在实验室中，将昆虫从叶片上分离出来并保存在100%乙醇中，以便进行拍照记录和后续的分子分析。

2.2. DNA提取和COI扩增

使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen，德国希伦登）从两只若虫和一只成虫中提取了基因组DNA。使用Platinum^TM Taq DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和引物LCO1490及HCO2198扩增了线粒体细胞色素氧化酶亚基I (COI)基因的658 bp条形码片段[6]。PCR条件如下：初始变性94°C 5分钟；35个循环，每个循环94°C 30秒、49°C 30秒、72°C 1分钟；最后延伸72°C 8分钟。扩增产物在琼脂糖凝胶上验证特异性，然后连接到pCR4-TOPO^? TA载体上，并转化到TOP10感受态细胞（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）中。通过克隆PCR鉴定阳性克隆，分离质粒DNA，并通过Sanger测序确定插入序列。

2.3. 序列分析和系统发育

使用BLASTN（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，访问日期2025年8月30日）将序列与GenBank核苷酸数据库进行比较。系统发育分析使用MAFFT（v7.505）和‘auto’设置对A. biguttula的代表序列进行比对[7]，并使用TrimAl（v1.2）根据0.25的间隙阈值进行修剪[8]。基于贝叶斯信息准则（Bayesian Information Criterion）在MEGA11中选择了最佳拟合替换模型（GTR+G）[9]。系统发育推断在MrBayes（v3.2.7）中进行了两次运行，每次运行四个链，直到分支频率的标准差低于0.01。前25%的代数被丢弃作为烧录期，剩余样本用于构建50%多数规则共识树。

3. 结果与讨论

棉花叶片表现出典型的“叶蝉灼伤”症状，包括变色和卷曲（图1A）。受感染植株上观察到了多个龄期的若虫和成虫（图1B–D）。成虫的前翅尖端有成对的暗斑（图1D），而若虫的翅基部色素沉着则表现不一致（图1B,C）。值得注意的是，通常位于头部顶端的一对小黑斑在我们的样本中缺失。这些色素特征在个体间可能存在差异，有时也可能较淡或缺失，这在A. biguttula的诊断资源中有提及[11]。若虫的体长随龄期而变化，而成虫的长度约为3毫米。尽管这些特征支持初步鉴定，但由于A. biguttula与相关Cicadellidae物种在形态上的相似性，以及某些生命阶段（尤其是幼虫和雌性成虫）缺乏可靠的诊断特征，因此需要通过分子方法进行确认，因为形态鉴定主要依赖于前翅斑点和雄性生殖器，而这些特征仅在成虫中存在或具有诊断意义[4]。

图1. Amrasca biguttula的形态及其对棉花叶片的损害。A 显示“叶蝉灼伤”症状的棉花叶片：变色（上）和卷曲（下）。B 若虫阶段：刚孵化的（上）、第一龄期（从上数第二个）、第二或更晚龄期（从下数第二个）以及无翅基部斑点的第三或更晚龄期（下）。C 更晚龄期的若虫，从背侧（上）、腹侧（中）和侧面（下）观察翅基部斑点。D 成虫，从背侧（上）、腹侧（中和侧面（下）观察前翅斑点。所有昆虫图像（B–D）均按照面板（C）中的参考条（1毫米）进行了缩放。

所有三个个体——两只若虫（一只具有翅基部色素沉着图1C>，一只没有图1B，底部）和一只成虫——都产生了相同的658 bp COI序列（GenBank访问号PX247763）。将该序列在GenBank核心核苷酸数据库中进行BLAST搜索，结果A. biguttula COI序列为最匹配的结果。序列比对显示美国序列与印度、中国和巴基斯坦收集的样本之间的相似度超过99%（图S1）。由于本研究侧重于物种鉴定而非种群水平分析，从样本中获得的COI序列足以确认物种身份。从三个样本中获得的相同序列代表该集合中的单一单倍型。

为了解决阿拉巴马州样本与亚洲A. biguttula序列之间的系统发育关系，包括通过形态学鉴定的样本（如MK391460（菲律宾）[12]、MN399899.1.1（越南）[13]和PP11539.1.1（印度）[14]），我们使用它们的COI序列进行了贝叶斯系统发育分析。结果将阿拉巴马州序列置于A. biguttula分支内，后验概率支持为100%（图2）。这一位置将其与其他Amrasca物种（例如，通过13形态学鉴定的A. splendens）以及Empoascini族内的非Amrasca分类单元区分开来。

图2. 美国Amrasca biguttula分离株在亚洲谱系中的系统发育位置。贝叶斯系统发育分析显示了A. biguttula的COI条形码区域，包括美国分离株（用红色突出显示）和代表性亚洲序列，以及其他Typhlocybinae亚科的物种。该树以Metidiocerus impressifrons（Eurymelinae亚科）为根。分类单元标签包括物种名称及其对应的GenBank访问号。标有星号（*）的序列表示通过形态学鉴定的样本。节点处的后验概率大于60%。比例尺表示每个位点的替换次数。

尽管在采集A. biguttula的棉花田中确认了其存在，但在2025年的采样期间并未观察到明显的产量损失。这可能反映了该害虫在该地区的入侵处于早期阶段：害虫在棉花结籽后才被发现，种群密度尚未达到较高水平。采集后喷洒了杀虫剂以减轻潜在的产量损失。虽然目前的产量影响似乎很小，但需要持续监测以评估其造成经济损失的潜力。未来季节种群数量可能会增加，这将需要通过准确的物种鉴定来确认。

由于A. biguttula成虫具有特征性的前翅斑点，因此相对容易识别。然而，这一特征在若虫中表现不一致，而若虫在田间调查中更常被采集，因为它们的移动能力有限。此外，棉花和其他宿主植物可能同时受到A. biguttula和其他形态相似的Empoascini物种（如马铃薯叶蝉Empoasca fabae [15]）的侵害，这使得若虫的形态学诊断不可靠。在这种情况下，分子诊断提供了一种可靠的方法，可以补充传统的形态学鉴定，从而实现准确的物种区分和混合侵染的检测，以支持适当的防控策略[16]。

本研究基于在阿拉巴马州收集的样本对A. biguttula进行了分子确认，为美国提供了首个分子验证的记录，对监管机构、研究人员和推广专家具有价值。尽管推广报告表明该害虫存在于几个南部州，但其在美国棉花系统中的分布范围和影响程度仍不确定。鉴于其广泛的宿主范围[1]，协调监测以及关于管理策略（如农业实践、生物控制和杀虫剂效果）的研究对于制定有效的综合害虫管理（IPM）策略至关重要。

补充材料

以下支持信息可在https://www.mdpi.com/article/10.3390/insects17030313/s1下载：图S1：四个Amrasca biguttula分离株的COI条形码区域的MAFFT比对结果。