使用Na?AlO?和Na?SiO?作为吸附剂优化双酚类物质在人血清中检测的净化策略：分子机制分析与关键因素评估

高效固相萃取方法及双酚类化合物检测技术研究。采用13X型沸石材料构建新型SPE方法，有效抑制血清基体效应（抑制率63.3%-121%），显著优于C18（15.0%-107%）、HLB（4.5%-87.7%）和PEP-2（8.9%-142%）等常规吸附剂。通过分子模拟和回归分析，阐明logKow值（P<0.01）和分子体积对回收率的关键影响，揭示沸石孔道尺寸筛选与氢键/静电作用协同的机制。方法在牛血清中验证，检出限0.075-0.39 ng/mL，RSD 2.2%-18.0%，准确度71.4%-124%，与参考方法Bland-Altman分析吻合度良好。

　　

Jing Jin|Cuicui Guo|He Zhang|Tian Tian|Bairong Fu|Longxing Wang|Dongqin Tan|Jiajia Yang|Ningbo Geng|Jiping Chen

中国科学院大连化学物理研究所，中国辽宁省大连市116023

摘要

背景

双酚类化合物作为普遍存在的环境污染物，由于其内分泌干扰特性，对公共健康构成了重大威胁。虽然液相色谱-串联质谱法是生物样本中双酚类化合物痕量定量分析的金标准，但其准确性受到显著基质效应的限制。开发适用于人体生物监测的分离技术和分析方法将显著推进人类健康风险评估。生物样本的复杂性和目标物质的低浓度是人体生物监测面临的主要挑战。开发适用于血清净化的高效且经济可行的固相萃取（SPE）吸附剂对于开展大规模流行病学和毒理学研究至关重要。

结果

我们提出了一种基于13X型Na₈₆(AlO₂)₈₆(SiO₂)₁₀₆沸石的净化方案，该方案实现了稳定的基质效应抑制（63.3%–121%），优于商业吸附剂C₁₈（15.0%–107%）、HLB（4.5%–87.7%）和PEP-2（8.9%–142%）。相关性分析表明，分析物的回收率与logK_ow显著相关（P<0.01），并且与估计的分子体积呈正相关。结合结合能分析，我们的发现表明沸石孔内的形状选择性和强相互作用（如氢键相互作用、静电相互作用）起着关键作用。该方法使用牛血清进行了验证，表现出可接受的灵敏度（0.075–0.39 ng mL^-1）、精确度（2.2%–18.0%）和准确性（71.4%–124%）。通过Bland-Altman分析，进一步证明了该方法在人体生物监测中的可靠性。

意义

基于沸石的SPE方案展示了良好的选择性和稳健性，使其成为血清中双酚类化合物生物监测的优越样品制备技术。该方法能够准确评估人体内部的双酚类化合物暴露情况。此外，通过多元回归分析和分子模拟，我们确定了影响提取效率和分子相互作用的关键因素，从而提供了可能的机制见解。

引言

随着双酚A（BPA）的淘汰，双酚S（BPS）和双酚F（BPF）等替代品的使用量正在增加。加拿大政府已将34种双酚类化合物（包括双酚AF（BPAF）、双酚S（BPS）、双酚F（BPF）、双酚B（BPB）、双酚AP（BPAP）、双酚E（BPE）和双酚Z（BPZ）列为需要进一步研究的物质（表S1）[1]，[2]。作为合成化学品，双酚类化合物广泛应用于各种工业产品（如环氧树脂、聚碳酸酯塑料）以及日常消费品（如食品容器、纸制品）的制造中。因此，双酚类化合物在环境和食物链中广泛存在[3]，[4]，[5]，[6]，[7]，[8]，[9]，[10]，[11]，[12]，[13]，[14]，引发了对其对人体和动物健康潜在不良影响的担忧[6]，[7]，[8]，[9]，[10]，[11]，[12]，[13]，[14]。然而，尽管它们在化学性质上相似，但其生物学效应仍知之甚少，可能与BPA具有重叠或不同的作用[15]。例如，BPAF作为ERα配体的效力约为BPA的48倍，能够干扰生理过程[16]。因此，准确测定双酚类化合物的浓度对于评估人体暴露风险至关重要[11]，[17]，[18]，[19]，[20]，[21]。 液相色谱与串联质谱联用是目前测定血清、血浆和血液中双酚类化合物含量的首选方法。该技术具有高特异性、灵敏度和高通量。然而，共洗脱的基质成分可能导致基质效应（离子抑制或增强），从而影响分析结果。几种方法可以减轻这些效应，包括样品稀释、蛋白质沉淀、优化样品制备和色谱分离以及使用内标来校正信号变化[22]，[23]。在识别这些化合物及其慢性、普遍暴露带来的健康影响方面，主要挑战在于生物样本的复杂性和这些分析物的低浓度[24]，[25]，[26]，[27]，[28]，[29]，[30]，[31]。 液-液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）仍是从生物样本中提取双酚类化合物的最常用技术[32]，[33]。多种SPE吸附剂已被用于生物样本中双酚类化合物的测定[27]，[34]，[35]，[36]，[37]，[38]，[39]，包括C₈-或C₁₈-键合硅胶、亲水-疏水平衡材料（HLB、PEP-2）、混合模式阳离子交换（MCX）、混合模式阴离子交换（MAX）、分子印迹聚合物（MIP）和免疫吸附剂。虽然C18和HLB等吸附剂通过反相相互作用（C18）或反相保留与水润湿性的结合（HLB、PEP-2）实现纯化和富集[28]，[40]，[41]，[42]，但对于某些双酚类化合物（如HLB上的BPAF、BPAP和BPZ；C18上的BPB和BPS），其回收率可能过低（例如<10%）。这凸显了开发具有增强选择性的SPE吸附剂（如分子印迹聚合物和功能化金属有机框架）的必要性，以提高分析物的回收率[31]，[43]，[44]，[45]，[46]。然而，关于这些新型材料的大多数研究仍处于基础阶段，尚未应用于实际的人体生物监测。开发适用于选择性及灵敏度分析双酚类化合物的可行且经济的SPE吸附剂是一个紧迫且未满足的需求，因为这对于推进大规模流行病学和毒理学研究至关重要。 沸石分子筛是一种微孔铝硅酸盐材料，具有分子筛分选择性，能够根据空间效应（即分子尺寸和构象）实现化合物的分离或负载[47]，[48]。先前的研究表明，它们能选择性吸附多氯二苯并呋喃类化合物，这种选择性受氯化程度和取代模式的影响[49]。这些发现表明，经过孔结构设计的沸石可以促进目标分子的渗透，分离效果主要受尺寸排阻和形状选择性的控制。尽管X型沸石已广泛用于气相小分子分离（如CO₂捕获）以及水溶性金属和染料的去除[50]，[51]，[52]，[53]，[54]，[55]，[56]，[57]，[58]，但其在液相分离有机污染物中的应用仍待探索。我们的最新研究表明，13X分子筛能有效分离血清中的多溴二苯醚（PBDEs），同时排除内源性干扰物[59]。然而，由于双酚类化合物和PBDEs在物理化学性质（如极性、疏水性和分子结构）上的差异，关于双酚类化合物在13X分子筛上的保留机制仍存在知识空白，特别是孔径限制效应和表面相互作用的作用尚不明确。 本研究旨在开发一种利用13X分子筛的高效SPE净化方法，用于测定血清中的八种双酚类化合物。我们系统评估了该方法在去除干扰物和减少基质效应方面的效率（与传统SPE吸附剂相比），以及影响回收率的关键分子级因素。基于这一评估，我们建立了一种结合13X SPE和HPLC-MS/MS的稳健且选择性的分析方法，用于复杂生物样本中痕量双酚类化合物的定量。

化学物质和试剂

BPF（双(4-羟基苯基)甲烷，纯度>99%）、BPA（2,2-双(4-羟基苯基)丙烷，纯度>99%）、BPE（4,4'-乙基联苯酚，纯度>99%）、BPAP（4,4'-(1-苯基乙叉)双酚，纯度>98%）、BPZ（4,4'-环己基联苯酚，纯度>98%）和BPB（2,2-双(4-羟基苯基)丁烷，纯度>98%）购自东京化学工业公司（日本东京北区）。BPAF（1,3-三氟-2,2-双(4-羟基苯基)丙烷，纯度>99%）和BPS（双(4-羟基苯基)砜）

SPE条件的优化

利用13X分子筛的SPE方案通过评估关键参数进行了系统优化，包括吸附剂用量、溶剂组成以及用于加载、冲洗和洗脱的体积。吸附剂用量不足可能导致保留不完全和分析物损失，尤其是在含有大量干扰物质的复杂环境样本中。因此，优化吸附剂用量对于实现定量回收和有效去除基质效应至关重要

结论

我们开发并验证了一种用于测定人体血清中双酚类化合物的有效方法，该方法结合了使用13X分子筛的固相萃取和HPLC–MS/MS分析。与传统的C18、HLB、PEP-2吸附剂相比，13X分子筛表现出更高的净化效率，有效减少了复杂生物样本中的基质干扰。特别是，logK_ow和结构驱动的提取机制得到了证实。

CRediT作者贡献声明

Longxing Wang：验证、监督、方法学、数据管理。 Bairong Fu：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证。 Tian Tian：撰写 – 审稿与编辑、监督、软件操作。 He Zhang：监督、研究、数据管理。 Jiping Chen：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、概念构思。 Ningbo Geng：撰写 – 审稿与编辑、资源协调。 Dongqin Tan：撰写 – 审稿与编辑、监督。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：22176188、22476194、22306054）的支持。

致谢

作者感谢Feng Ren和Xueqin Zhao在血清采样方面提供的帮助。