CRISPR/Cas12a介导的电化学发光生物传感器结合了银修饰的掺钴金属有机框架，用于同时检测马拉硫磷和磷胺酯

《Analytica Chimica Acta》：CRISPR/Cas12a-mediated electrochemiluminescent biosensor integrating Ag modified Co-doped metal-organic frameworks for dual detection of malathion and phorate

农药残留快速检测方法研究及在蔬菜中的验证，采用CRISPR/Cas12a基因编辑系统结合球形核酸（SNA）策略，构建Ag@Co-PTC纳米复合材料介导的电化学发光（ECL）双检测系统，实现马拉硫磷（0.108 pM）和磷胺（1.01 pM）的高灵敏度同步检测，回收率95.7%-106.4%，有效解决交叉干扰问题。

　　

张颖|刘文珂|郭荣|齐艳丽|白宝清|张金华|胡楠|顾颖|杨玉坤|王硕

生命科学学院，教育部化学生物学与分子工程重点实验室，山西大学，太原030006，中国

摘要

背景

随着对食品安全问题的日益关注，检测食品中的农药残留变得愈发重要。混合有机磷农药（OPs）制剂常被用于提高作物产量；然而，过量使用OPs对食品安全和人类健康构成了严重威胁。因此，迫切需要开发能够同时检测食品样本中多种OPs的快速、灵敏的分析方法。目前，关于高性能电化学发光（ECL）传感器用于两个或更多目标检测的研究报道较少。

结果

本研究报道了一种基于CRISPR/Cas12a的ECL生物传感器，用于同时检测两种有机磷农药——马拉硫磷和磷脂酸酯。金属有机框架材料（Co-PTC）负载银纳米粒子（AgNPs@Co-PTC）作为单信号探针，其中Co-PTC作为ECL发射体，AgNPs作为共反应加速剂有效放大ECL信号。该方法通过将生物传感器与马拉硫磷和标记有黑洞淬灭剂1（BHQ1-DNA）的DNA孵育获得关闭的ECL信号；随后，将磷脂酸酯转化为激活DNA后，CRISPR/Cas12a的旁路活性被激活，从而产生开启的ECL信号。通过将球形核酸切换策略与CRISPR/Cas12a结合进行信号放大，该方法实现了马拉硫磷的检测限为0.108 pM，磷脂酸酯的检测限为1.01 pM（信噪比=3），在食品样本（卷心菜和生菜）中的回收率达到了95.7%-106.4%。

意义

这种双检测模式消除了对多个信号报告剂的需求，简化了检测流程，并有效避免了交叉干扰。因此，基于CRISPR/Cas12a的ECL生物传感器具有高选择性和稳定性，为食品安全监测提供了一种新的分析策略。

引言

有机磷农药（OPs）（如马拉硫磷和磷脂酸酯）常用于农业生产中的害虫控制，以提高作物产量[1]。然而，过量使用有机磷农药会导致农产品中残留有害农药，对食品安全和人类健康构成严重威胁。在农业生产实践中，通常使用混合OPs制剂来提高作物产量，从而导致食品基质中同时存在多种OPs残留[2]。这些有毒化合物进入人体后会不可逆地抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）活性，导致乙酰胆碱积累，进而引起中枢和周围神经系统的神经功能障碍，最终可能导致严重的生理后果[3]。因此，迫切需要开发能够同时检测食品样本中多种OPs的快速、灵敏的分析方法，这对确保消费者安全和满足监管要求具有重要意义。

传统的OPs检测方法主要依赖于色谱技术，包括高效液相色谱（HPLC）和气相色谱-质谱（GC-MS）[4]、[5]。然而，这些方法耗时较长，通常需要复杂的样品预处理程序、精密的仪器和熟练的操作人员。免疫测定作为一种替代分析技术出现[6]，利用抗体和抗原之间的特异性生化相互作用。这些测定通过将抗体或抗原与比色、荧光或电化学标记物结合来实现高灵敏度检测。尽管免疫化学相互作用具有高亲和力，但免疫测定常常对结构相似的化合物表现出显著的交叉反应性，导致假阳性结果和特异性降低。此外，由于抗体的固有特性，免疫传感器在应用于生物样本时经常遇到稳定性和重复性挑战[7]。

电化学发光（ECL）传感技术因其低背景信号、操作简单和良好的可控性而成为多重检测的重要分析工具[8]。近年来，由于发射体的发光依赖于电位，已经开发了基于电位分辨的ECL策略用于多目标检测。例如，Jiang等人合成了具有可调带隙的Cu-Zn-In-S/ZnS纳米晶体作为ECL发射体用于多重miRNA检测[9]。此外，由于ECL通过电激发产生光信号，发射光的波长也可以作为分辨率策略。Yu等人使用BSA-Ag NCs、CdSe NCs和CdTe NCs作为ECL信号探针同时检测cTnI、CA125和CA19-9[10]。然而，上述ECL介导的多重检测策略无法消除不同信号探针之间的交叉反应性，使得开发能够克服这种交叉反应性的多重ECL检测方法特别具有挑战性。

CRISPR/Cas12a介导的球形核酸（SNA）策略为这一问题提供了解决方案。CRISPR/Cas系统可以通过直接或间接激活效应蛋白的切割活性来引起信号变化[11]、[12]、[13]。其中，Cas12a系统操作简单，激活的Cas12a表现出对任意单链DNA的非特异性切割（跨切割活性）[14]、[15]。Cas12a的跨切割活性严格依赖于其配体CRISPR RNA（crRNA）与特定激活DNA（aDNA）的杂交。只有目标衍生的aDNA才能解锁其跨切割活性，从而有助于消除背景交叉反应性[16]。SNA作为非核酸目标与CRISPR/Cas12a之间的关键桥梁，通过将目标转化为序列特异性的aDNA来独立捕获干扰物[17]。因此，与CRISPR/Cas12a的序列锁定相结合，它们形成了双重特异性级联，增强了基质的鲁棒性，有效克服了交叉反应性。然而，目前关于CRISPR/Cas12a介导的SNA策略用于非核酸目标的多重检测的报道较少。

金属有机框架（MOFs）由有机配体和无机金属离子有序自组装而成，具有晶体网络和优异的物理/化学性质，这促进了它们在各个领域的应用[18]、[19]、[20]、[21]。由于其优异的性质（如高表面积、可调孔径和永久孔隙性），MOFs被认为是ECL传感的最佳选择[22]。例如，Zhao等人合成了具有湮灭型ECL发射体的Eu-MOF，用于痕量检测屈曲醇[23]。同样，Yang的团队使用负载金纳米粒子的UiO-66-NH₂作为ECL淬灭剂，实现了对淀粉样蛋白-β24的灵敏检测[24]。在MOFs中选择合适的有机配体对于优化ECL性能至关重要。3,4,9,10-苝四羧酸二酐（PTCDA）是一种典型的多环芳烃，具有平面结构和优异的光学性质，常被用作ECL发射体[25]。然而，其固有的聚集引起的淬灭（ACQ）倾向常常导致发光强度降低。通过在MOFs中引入PTCDA作为配体，可以有效缓解ACQ效应，从而增强发射强度[26]。

受以上研究的启发，构建了一种ECL生物传感器，结合CRISPR/Cas12a基因编辑系统和球形核酸（SNA），用于同时检测OPs（马拉硫磷和磷脂酸酯），其中改性的Ag掺杂MOFs（Ag@Co-PTC）作为单一ECL发射体。作为ECL发射体的MOF具有较大的比表面积，显著提高了AgNPs的负载能力。AgNPs不仅改善了复合材料的生物相容性，还作为共反应加速剂有效放大ECL信号。在马拉硫磷存在的情况下，可以将BHQ₁-DNA引入电极表面，通过电化学发光共振能量转移（ECL-RET）过程降低发光信号强度；随后，通过将磷脂酸酯浓度转化为激活的Cas12a量，从电极表面去除BHQ₁，从而恢复信号。因此，结合球形核酸切换策略，建立的CRISPR/Cas12a介导的ECL生物传感器扩展了CRISPR/Cas12a的应用范围，并为非核酸目标的高效放大提供了途径。

部分摘要

试剂和仪器

实验中使用的试剂和仪器详细信息见补充信息和表S1。

Co-PTC的合成

Co-PTC按照先前报道的方法合成，并进行了轻微修改[27]。首先，将PTCDA（0.394 g）和KOH（0.280 g）分散在去离子水中（5 mL），在55 °C下搅拌12小时，然后加入30 mL乙醇形成黄色沉淀。沉淀物通过离心收集，并在40 °C下真空干燥至

Co-PTC和Ag@Co-PTC的合成与表征

Co-PTC和Ag@Co-PTC纳米复合材料的合成示意图见图1A。高性能的ECL发射体在ECL传感中至关重要。在本研究中，将具有平面结构和优异光学性质的PTCDA作为配体引入MOFs中，形成了Co-PTC，有效缓解了其固有的ACQ效应[25]、[26]。然后，在Co-PTC上修饰AgNPs，即Ag@Co-PTC纳米复合材料，提高了其生物相容性

结论

在这项研究中，我们开发了一种基于CRISPR/Cas12a适配体的生物传感器，用于同时检测食品样本中的马拉硫磷和磷脂酸酯。该传感器使用Ag@Co-PTC纳米复合材料作为高效的ECL发射体，结合适配体特异性识别、球形核酸介导的信号转换和CRISPR/Cas12a的辅助切割活性，实现了高灵敏度和选择性的双重目标检测。

CRediT作者贡献声明

白宝清：写作 – 审稿与编辑，资金获取。齐艳丽：写作 – 审稿与编辑。郭荣：写作 – 审稿与编辑。杨玉坤：写作 – 审稿与编辑，项目管理，资金获取。顾颖：写作 – 审稿与编辑，项目管理，资金获取。胡楠：写作 – 审稿与编辑。张金华：写作 – 审稿与编辑。刘文珂：写作 – 初始草稿，软件开发，实验研究。张颖：写作 – 审稿与编辑，项目管理

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中央政府指导地方科技发展基金项目（编号：YDZJSX2025D009；山西省基础研究计划（自由探索）（编号：202403021222017）；国家自然科学基金（编号：32072301；云南省重大科技项目（资助编号：202402AE090040）的财政支持。作者感谢来自SCl-GO的Weihong Chu（www.sci-go.com）提供的XPS分析。