《Bioactive Materials》：Reprogrammable 4D tissue engineering hydrogel scaffold via reversible ion printing
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本文针对当前可变形水凝胶支架制备复杂、多限于单向变形且难以重编程的问题，报道了一种基于离子转移印刷（ITP）技术的新型可重构水凝胶系统。该研究利用一种快速、简单、稳健的策略，在载细胞水凝胶中引入可调离子交联密度梯度，实现了预设的程序化变形。结合表面图案化技术，可获得能向多方向形变的复杂三维生物结构。该变形结构不仅能通过化学处理恢复原状，还能在用户指定时间点通过ITP过程植入新的、空间可控的梯度交联，从而实现三维生物结构形状的重编程。最终，该研究在工程化软骨样组织构建物中实现了有效的形状操控。这种形态可变的支架通过实现对构建物形状演化的复杂时空控制，有望推动4D组织工程的发展。
想象一下，如果我们能像捏橡皮泥一样，随意塑造和重塑活体组织的三维形状，那将为组织修复和再生医学带来怎样的变革？这正是“4D组织工程”所追求的愿景——在3D打印的基础上，增加“时间”这一维度，让构建的组织能够像自然发育中的组织一样，动态地改变其形态。然而，现实中的挑战不小。目前大多数可变形水凝胶支架依赖于多层不同材料的复合结构，这不仅制备过程繁琐耗时，而且形变往往局限于单一方向。更重要的是，一旦成型，其形状就难以再次更改，这与生物体内组织随发育阶段不断调整形态的动态特性相去甚远。为了攻克这些瓶颈，一项发表在《Bioactive Materials》上的研究带来了突破。研究人员开发了一种简单、快速且可逆的策略，能够对载有活细胞的柔软水凝胶进行“编程”和“重编程”，使其像拥有生命一般，在预设的时间点弯曲、卷曲，甚至变幻出花朵般的复杂三维结构。
本研究主要运用了几项关键技术：首先，合成了具有光交联和离子交联双重能力的氧化甲基丙烯酸化海藻酸（OMA）作为核心水凝胶材料。其次，创新的离子转移印刷（ITP）技术是核心，它通过将浸泡了钙离子（Ca2+）溶液的滤纸贴附于水凝胶表面，短时间内在凝胶厚度方向上形成离子交联密度梯度。再次，结合表面图案化技术，通过使用特定形状的Ca2+滤纸，在凝胶表面实现局部区域化交联。最后，利用乙二胺四乙酸（EDTA）螯合去除Ca2+，以消除梯度、使形变恢复，从而实现形状的重编程。研究所用人骨髓间充质干细胞（hMSC）来源于经机构审查委员会（IRB）批准的、去标识化的细胞库。
研究结果
1. ITP诱导的梯度结构形成与可控变形
研究人员证实，通过ITP技术，能够在光交联的OMA水凝胶中成功构建贯穿厚度的Ca2+交联密度梯度。扫描电镜（SEM）和荧光染料标记实验直观地展示了梯度孔隙结构的存在。这种梯度导致了水凝胶在培养液中发生差异溶胀，从而驱动其发生预设的弯曲变形。实验系统探究了影响变形行为的多个参数：
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溶液环境：在水（H2O）中溶胀最大，弯曲角度最显著，其次是在细胞生长培养基（GM）和磷酸盐缓冲液（PBS）中。
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材料浓度：OMA浓度增加会抑制溶胀，从而降低弯曲角度。
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ITP参数：提高Ca2+储备液浓度或延长ITP时间，可增强梯度范围，从而产生更大的弯曲角度。
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几何尺寸：水凝胶条的长度和厚度增加会增大弯曲角度，而宽度的影响可忽略。这些发现表明，可以通过精确调控这些参数来“编程”水凝胶的最终变形形态。
2. 载细胞构建物的形变与细胞相容性
研究成功将成纤维细胞（NIH3T3）和人骨髓间充质干细胞（hMSC）封装进水凝胶中。载细胞的水凝胶条在GM中能在约3分钟内快速弯曲成“C”形。细胞密度增加会轻微减小弯曲角度。活/死染色结果表明，在形变过程后，封装细胞保持了高存活率，证明了该形变系统的生物相容性。此外，通过裁剪大块水凝胶，成功制备了能够整体弯曲的载细胞圆盘和方形平板构建物。
3. 图案化引导的复杂3D结构构建
通过“图案化ITP”技术，实现了更复杂的多方向形变。例如，对水凝胶条进行分段图案化交联，可使其产生不对称、多方向弯曲，形成“S”形等复杂二维结构。更进一步，使用具有特定几何形状（如圆盘、十字、Y形）的Ca2+滤纸对盘状构建物进行局部交联，由于图案区溶胀被抑制，而非图案区溶胀显著，最终诱导整个圆盘发生“2D到3D”的形变，形成了波浪状或花朵状的复杂三维生物结构。
4. 形状的重编程与“3D到3D”转换
本研究最突出的亮点是形状的“可重编程性”。由梯度交联引起的内部应变可以通过EDTA处理消除，从而使弯曲的水凝胶恢复平直状态。随后，对恢复后的水凝胶进行第二次ITP（可在同一面或另一面），即可使其按照新的预设方式（例如反向弯曲）再次变形。这一过程在载细胞和无细胞水凝胶中均得到验证，且经过五个重编程循环后，细胞仍保持高活性。利用这种可逆性，研究首次在大型生物构建物（如平板和圆盘）上实现了独特的“3D到3D”形状转换，即从一个复杂的三维形态，通过恢复和再编程，转变为另一个不同的三维形态，这比常见的“2D到3D”转换更具挑战性，也更贴近生物体内复杂的形态动力学。
5. 在工程化软骨样组织中的验证
为验证该系统在4D组织工程中的应用潜力，研究以hMSC软骨分化作为概念验证模型。将hMSC封装在OMA与少量甲基丙烯酸化明胶（GelMA）混合的水凝胶中，并在软骨诱导培养基中培养21天，成功形成了软骨样组织。生化分析显示，实验组比对照组产生了显著更多的糖胺聚糖（GAG）。组织学染色（如苏木精-伊红（H&E）和番红O（SafO））证实了细胞均匀分布及丰富的GAG分泌。关键的是，对这些已分化21天的工程化组织进行ITP处理，它们仍然能够发生形变，并且可以进行重编程，尽管由于大量细胞外基质（ECM）的产生，其形变程度小于未分化的构建物。这证明了该技术能够对“即用型”的成熟组织构建物进行形状操控。
研究结论与意义
该研究基于ITP技术，成功开发了一种简单而强大的策略，实现了基于生理相关刺激的软组织多尺度结构形变。通过形成可逆的梯度交联，研究人员使大块载细胞海藻酸水凝胶能够进行预设程序和可重编程的形状变化。通过精细调控培养介质、ITP时间、大分子浓度和Ca2+浓度等参数，并结合表面图案化技术，能够精确控制构建物产生多重、多方向的形变，从而在组织成熟的不同阶段生成复杂的三维组织构建物。
这项工作的意义重大。首先，它为解决当前4D生物制造中制备复杂、变形模式单一且不可逆的难题提供了一种快速、简便、低成本的方案。其次，系统卓越的可重编程性和“3D到3D”转换能力，使得在单个构建物上模拟生物发育过程中连续的形态演变成为可能，为研究形态发生学和力学生物学提供了独特平台。再者，能够在分化后的组织构建物上进行形状编程，意味着未来有可能根据患者特定的组织缺损形状，对“现成”的工程化组织进行个性化塑形，从而促进与宿主组织的无缝整合，在个性化医疗中具有巨大潜力。
尽管该技术的体内应用（如对已植入的构建物进行直接操作）仍需进一步探索，但其在培养液中自松弛的特性，本身就为开发能够以紧凑状态输送、并在目标部位自发展开的自部署植入物提供了新思路。总而言之，这项研究不仅为4D组织工程提供了一个可靠且功能强大的新平台，也为开发自适应生物材料、生物驱动器和生物电子学等领域开辟了新的道路。
