《Biochemical Engineering Journal》：Redirecting formic acid flux and balancing redox for high-yield succinic acid production in
Actinobacillus succinogenes
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本研究通过CRISPR-Cas9基编辑技术敲除ΔpflB菌株的丙酮酸甲酸裂解酶基因，抑制副产物甲酸和乙酸生成，并过表达malate dehydrogenase、transhydrogenase和formate dehydrogenase以调节NADH水平。通过实验室进化获得G100菌株，其摇瓶和发酵罐中丁二酸产量分别提升37.2%和39.2%，揭示了FA代谢途径对丁二酸合成的关键作用及NADH/NAH+比值平衡的重要性。
袁天|陈春梅|史兴兰|吴丹|陈鹏城|郑普
教育部工业生物技术重点实验室，江南大学生物技术学院，中国无锡214122
摘要
琥珀酸（SA）是一种重要的有机二元羧酸，在化工、制药和食品工业中有着广泛的应用。Actinobacillus succinogenes是一种天然的琥珀酸生产菌株，被认为具有很大的工业潜力。然而，在SA生物合成过程中产生副产物如甲酸（FA）和乙酸（AA）仍然是主要挑战之一。在这项研究中，我们重点关注了A. succinogenes中FA代谢途径的作用。通过使用A. succinogenes的碱基编辑器CBE使丙酮酸甲酸裂解酶失活，获得了一种抑制FA途径的菌株ΔpflB，并对其生长、SA产量以及细胞内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）进行了研究。随后，我们尝试通过过表达苹果酸脱氢酶（mdh）、转氢酶（pntAB）和甲酸脱氢酶（fdh）来恢复NADH的再生，以调节ΔpflB菌株的细胞内NADH水平和NADH/NAD?比率。我们发现A. succinogenes中的FA途径对生长代谢和SA生物合成中的氧化还原平衡至关重要。最终，通过适应性实验室进化，经过100代培养后获得了一种生长优势更强的进化菌株G100。与亲本菌株相比，其在摇瓶培养和3升发酵罐中的SA产量分别提高了37.2%和39.2%。同时，进化后细胞内的NADH水平和NADH/NAD?比率也发生了显著变化。ΔpflB菌株显示出在工业应用中的潜力。
引言
琥珀酸（SA）是一种重要的有机二元羧酸，不仅是三羧酸（TCA）循环中的关键中间体，也是合成可生物降解塑料、药物中间体和食品添加剂的重要平台化学品[1]、[2]、[3]、[4]。美国能源部将SA列为十二种最具前景的生物基大宗化学品之一[5]。它可作为合成高价值化学品（如己二酸、四氢呋喃和1,4-丁二醇）的前体[6]、[7]。目前SA的合成方法包括化学合成和微生物发酵。基于内源性代谢途径的微生物生产SA因其底物利用广泛、能耗低且环保而越来越受到青睐[1]。目前，越来越多的微生物被用于SA的合成，例如天然菌株Actinobacillus succinogenes [8]、Mannheimia succiniciproducen [9]、Anaerobiospirillum succiniciproducen [10]，以及工程菌株，包括Escherichia coli [11]、Corynebacterium glutamicum [12]、Saccharomyces cerevisiae [13]、Yarrowia lipolytica [14]和Aspergillus niger [15]。其中，A. succinogenes因其高效的SA生产能力、固定CO?的能力、广泛的底物谱和高度稳定性而受到广泛关注[16]、[17]、[18]。
A. succinogenes 130Z（ATCC编号55618）最初由Guettler等人从牛瘤胃中分离出来[19]，通过筛选耐氟乙酸钠的菌株获得了副产物AA减少且对钠和氨离子抗性增强的突变菌株，这些突变菌株的SA浓度可达到80–110?g/L [20]。这开启了对该菌株进行SA发酵研究的探索。通过同位素标记分析，阐明了A. succinogenes生产SA的基本代谢途径[21]、[22]：该过程始于糖酵解，葡萄糖被降解为磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）。通过C3途径，PEP产生副产物FA和AA；而C4途径的碳流则导向最终产物SA。苹果酸酶（ME）和草酰乙酸脱羧酶（OAC）连接了C3和C4途径，形成了两者之间的可逆分支（图1）。随后，A. succinogenes的完整基因组被测序和注释，进一步发现A. succinogenes缺乏完整的三羧酸循环和乙醛酸途径，但它含有许多参与碳水化合物吸收和降解的基因，从而能够运输和代谢多种碳水化合物[23]。随后，通过合理的代谢工程增强了A. succinogenes的SA产量，重点消除FA和AA等副产物途径，以优化碳流向SA的分配。例如，开发了一种无标记的A. succinogenes敲除方法，并用于构建基因敲除突变体以敲除竞争性碳途径成分[24]、[25]。基于dCpf1的A. succinogenes CRISPR干扰（CRISPRi）系统也被建立起来，用于显著下调控制副产物乙酸合成的ackA基因的表达[26]。此外，还开发了由Cas9核酸酶和脱氨酶融合而成的A. succinogenes碱基编辑器（BEs），包括CBE（胞嘧啶碱基编辑器）、ABE（腺嘌呤碱基编辑器）、Td-GABE（A/G碱基编辑器）和Td-CBE（胞嘧啶碱基编辑器），用于使目标基因失活[27]。然而值得注意的是，A. succinogenes中的SA生物合成与细胞生长紧密相关，其生产率会随着生长速率的下降而显著降低[28]。阻断副产物途径可能与辅因子的生成有关，这些辅因子对于维持正常的细胞代谢和供应SA生物合成所需的辅因子至关重要[29]。Jiang等人通过同源重组破坏了编码丙酮酸甲酸裂解酶激活蛋白的< />基因，但ΔpflA菌株的乳酸产量仅为43?g/L，这表明碳流发生了重新分配[30]。因此，消除竞争性途径不仅重新分配了碳流并改变了辅因子的可用性，还扰乱了氧化还原平衡，重塑了细胞代谢网络，从而在菌株改良过程中产生了新的瓶颈[31]。
氧化还原平衡是代谢工程、菌株开发和发酵过程设计及控制的关键因素。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）是SA合成中的主要限制因素之一[32]。其生成和分配直接决定了代谢效率和产量。例如，在E. coli中异源表达Candida boidinii的NAD?依赖性甲酸脱氢酶基因（fdh）能够促进NADH的再生，使SA的滴度和产量分别达到20.29?g/L和1.15?g/g，同时将FA的积累量降低到0.14?g/L [33]。同样，通过优化戊糖磷酸途径并结合转氢酶的过表达，促进了NADPH向NADH的转化，从而提高了细胞内NADH水平，使SA的滴度和产量分别达到45.2?g/L和1.07?g/g [34]。总体而言，这些发现表明，在厌氧条件下，SA合成高度依赖于NADH，NADH的供应和分配不仅决定了碳流向SA的效率，也是限制高产量的关键因素[35]、[36]。此外，NADH/NAD?比率反映了细胞的氧化还原状态，影响细胞功能、代谢类型和底物运输，因此对维持生长也至关重要[37]。然而，细胞内NADH/NAD?比率受多种因素影响，包括环境条件、底物的氧化还原状态、生理状态、天然或外源电子受体的存在以及氧化还原酶的表达[38]、[39]。
由于FA或甲酸参与了由甲酸脱氢酶（FDH）催化的独特代谢反应，在A. succinogenes中产生NADH和CO?，FA途径（从PEP开始，通过丙酮酸裂解生成FA并分解为CO?）可能在能量平衡和碳流分配中起重要作用[40]。然而，关于FA代谢在A. succinogenes中的调控作用的研究仍然有限。在这里，我们通过构建菌株来阐明FA代谢途径在A. succinogenes SA合成中的作用，包括使丙酮酸甲酸裂解酶（PFL失活以及通过代谢工程调节细胞内NADH含量和NADH/NAD+比率。在删除FA途径后，考虑到影响NADH/NAD?比率的多种因素，对ΔpflB进行了适应性实验室进化，以筛选出生长和SA产量更优的菌株。我们的研究为NADH的可用性、NADH/NAD?稳态与SA生物合成之间的关系提供了重要见解，有助于进一步优化代谢网络以提高SA产量。
部分摘录
细菌菌株和质粒
本研究中使用的菌株和质粒列在表S1中，引物见表S2。Escherichia coli JM109被用作质粒克隆的宿主，在添加了氨苄西林（100?μg/mL）的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上于37 °C培养进行筛选。A. succinogenes CCTCC编号M2012036（命名为ZK）作为对照菌株CK，在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）液体培养基或固体琼脂培养基中厌氧培养，必要时添加氨苄西林（100?μg/mL）丙酮酸甲酸裂解酶失活对生长和酸产量的影响
使用基于CRISPR-Cas9的碱基编辑器CBE [27]，选择位于C3途径中并与FA合成相关的丙酮酸甲酸裂解酶基因作为基因沉默的目标。基于计算模拟和预测，设计了一个具有低脱靶得分的sgRNA来构建敲除质粒。如图2a所示，基因在613?bp位置的胞嘧啶被转换为胸腺嘧啶，从而引入了一个提前终止密码子结论
在这项研究中，我们研究了FA代谢途径在A. succinogenes SA合成中的作用，该途径涉及丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）裂解丙酮酸生成FA和甲酸脱氢酶降解FA。首先，使用碱基编辑器CBE成功构建了PFL失活的ΔpflB菌株。ΔpflB菌株的生长和SA产量均有所降低。尽管在发酵过程中没有FA副产物，但发酵过程中缺乏FA会导致
CRediT作者贡献声明
史兴兰：可视化。吴丹：形式分析。陈鹏城：资金获取、形式分析。袁天：写作 – 审稿与编辑、写作 – 原稿撰写、验证、方法学、研究、形式分析、数据管理、概念化。陈春梅：资源获取、方法学。郑普：验证、监督、资金获取、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
