从发酵的带鱼（Trichiurus lepturus）酱中分离出的Virgibacillus sp. KFRI-KCUT25010的完整基因组序列

韩国发酵鳕鱼酱中分离的Virgibacillus sp. strain KFRI-KCUT25010经Illumina NovaSeq X和PacBio Revio HiFi测序，获得3.78 Mb单圈染色体，GC含量39.6%。与近缘种比较，其平均核苷酸身份（79.12%）和氨基酸身份（79.99%）显著低于物种阈值（95%-96%），表明该菌株属于基因组独特谱系。

　　

摘要

Virgibacillus sp. 菌株KFRI-KCUT25010是从韩国发酵的竹荚鱼酱中分离出来的，并使用Illumina NovaSeq X和PacBio Revio HiFi技术进行了测序。该基因组包含一个3.78 Mb的环状染色体，GC含量为39.6%。基于ANI（Average Nucleotide Identity）的比较分析表明，该菌株在基因组上属于Virgibacillus属中的一个独特谱系。

公告

Virgibacillus属（属于Bacillaceae科）包含中度嗜盐、能形成内孢子的细菌，这类细菌经常从盐环境中和发酵食品中分离出来，尤其是发酵海鲜中，是发现新型嗜盐菌类的关键生态位（1–5）。KFRI-KCUT25010菌株是在2024年从韩国江京（36.15° N, 127.01° E）当地市场购买的一种发酵竹荚鱼（Trichiurus lepturus）酱中获得的。取20克样品，用180毫升无菌0.85%（w/v）NaCl通过匀浆器进行匀浆处理，然后进行系列稀释（10^?3至10^?5），并涂布在Marine Agar 2216（Difco）培养基上。培养物在30°C下 aerobic 条件下培养72小时。从中纯化出一个菌落，并保存在-80°C、20%（v/v）甘油溶液中。基因组DNA按照QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN）的制造商协议进行提取。

全基因组测序采用了混合方法，结合了Illumina NovaSeq X的短读长文库和PacBio Revio的长读长文库（HiFi CCS读长）。Illumina文库是使用Nextera DNA Flex Library Prep Kit（Illumina）按照制造商的协议制备的，未做任何修改。Illumina测序在NovaSeq X平台上进行，生成2 × 151 bp的配对末端读长。PacBio文库使用SMRTbell Express Template Prep Kit v2.0制备，不进行DNA剪切或大小筛选，然后在PacBio Revio平台上使用HiFi CCS化学方法进行测序。读长质量使用FastQC v0.11.7进行评估（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）。使用Trimmomatic v0.38去除Illumina接头和低质量碱基（6）。使用Jellyfish v1.1.12进行k-mer计数。长读长使用Canu v1.7进行组装，组装结果使用Pilon v1.22进行优化，并通过Microbial Genome Analysis pipeline（SMRT Link v13.1.0.221970）以混合方式进行精细化处理（7, 8）。PacBio HiFi读长使用pbmm2 v12.1进行比对和验证（https://github.com/PacificBiosciences/pbmm2）。基因组完整性使用BUSCO v5.1.3和bacteria_odb10数据集进行评估（9）。结构和功能注释使用NCBI PGAP和Prokka v1.14.6生成，功能分配参考eggNOG v4.5（10, 11）。对于环状基因组，在组装过程中识别出末端重叠部分，并修剪以生成一个单一的环状contig，然后将染色体旋转，使其以< />基因为起始点。除非另有说明，否则使用默认参数。成对16S rRNA基因的同一性、ANI（Average Nucleotide Identity）和AAI（Average Amino Acid Identity）按照之前的方法计算（12–14）。

Illumina NovaSeq X产生了22,270,204个配对读长（3.36 Gb；Q30为95.7%），而PacBio Revio HiFi产生了83,782个环状共识读长（625.7 Mb；读长N50为8,775 bp）。De novo组装得到了一个单一的环状染色体，详细的基因组统计信息总结在表1中。根据BUSCO分析，组装完整性为99.2%，表明基因组接近完整。基因组组装和注释的统计信息也总结在表1中。我们将16S rRNA基因比较与全基因组相关性分析结合起来。从组装结果中检索出16S rRNA基因。基于EzBioCloud的16S rRNA基因鉴定显示，最接近的已发表的模式菌株是Virgibacillus natechei FarD?（NCBI组装号ASM2601364v1），序列相似度为96.91%。比较基因组分析显示，KFRI-KCUT25010菌株的平均核苷酸同一性（ANI）值为79.12%，平均氨基酸同一性（AAI）值为79.99%。这些值远低于常用的95%–96%的物种划分阈值。总体而言，这些结果表明KFRI-KCUT25010菌株在Virgibacillus属内代表了一个基因组上独特的谱系（15）。

表1

表1 Virgibacillus sp. KCUT25010的基因组组装和注释统计信息

特征	值
基因组大小（bp）	3,776,343
GC含量（%）	39.6
Contigs（拓扑结构）	1a
平均覆盖率（×）	166
Contig N50（bp）	3,776,343
总基因数	3,851
蛋白质编码基因（CDS）	3,765
rRNA	6, 6, 6（5S, 16S, 23S）
tRNA / ncRNA	63 / 5
BUSCO完整性（%）	99.2

^a

单个环状染色体。

致谢

本研究得到了韩国食品研究所（项目编号E0211502-06）的资助。