矩阵引导的类胚胎侵袭技术使得三维心脏类器官能够实现类似房室同步的收缩

《Biomaterials》：Matrix-guided embryo-like invasion enables 3D heart organoids with atrioventricular synchrony-like contraction

本研究设计了一种基于胶原蛋白的双面Janus膜（CuHA/PA@PLGA/Col），通过不对称双层结构结合电化学沉积技术，实现致密屏障层和多孔修复层的功能分区。该膜具有抗菌、抗氧化及骨传导特性，通过铜离子释放和花青素缓释调控炎症微环境，促进血管生成和巨噬细胞向抗炎M2表型极化，显著改善感染性颅骨和糖尿病牙周骨缺损的再生效果。

　　

作者名单：常东彪、李林珂、林卫民、张嘉豪、张慧、杨新曦、白玲玲、段国文、盛军、郭泰林、李建树、袁全、谭欢、翁杰、王梦媛

中国四川省成都市610041，华西口腔医院国家口腔疾病临床研究中心，国家口腔疾病重点实验室

摘要

在复杂的病理环境中（例如感染或糖尿病），骨骼再生尤其具有挑战性。传统的胶原屏障膜通常会迅速降解，并且缺乏多功能生物活性，这限制了它们在这种条件下的有效性。本文介绍了一种基于胶原的Janus膜，用于在这些具有挑战性的环境中实现先进的引导性骨骼再生。该膜具有不对称的双层结构：软组织侧由电沉积形成的致密屏障层组成，而骨缺损侧则由多孔修复层构成。修复层含有掺铜的羟基磷灰石颗粒和负载天然多酚类物质原花青素的PLGA微球，赋予膜强大的抗菌、抗氧化和促骨生成特性。来自矿物相的铜离子能够刺激血管生成信号并促进新血管的形成，而原花青素则能稳定胶原基质并减轻炎症。同时，电沉积的屏障层增强了膜的机械强度和结构完整性，有效防止了软组织的渗透和细菌的侵袭。此外，该膜还能调节巨噬细胞的葡萄糖代谢和线粒体自噬，从而减少活性氧的产生，并促进巨噬细胞向抗炎M2表型的转变，创造出有利于新骨形成的骨免疫环境。在感染性颅骨缺损和糖尿病性牙周缺损的大鼠模型中，该膜在病理压力下仍能保持其屏障保护和微环境调节能力，从而促进组织再生。因此，这种基于胶原的Janus膜为感染或代谢性疾病等复杂临床场景中的引导性骨骼再生提供了一种有前景的策略。

引言

骨缺损是一个常见且棘手的临床问题，通常由创伤、肿瘤切除或糖尿病等代谢性疾病引起。特别是当骨缺损伴随感染或在糖尿病患者中发生时，愈合过程会变得异常漫长和困难[1],[2],[3]。在感染的骨缺损中，持续的细菌会破坏局部免疫微环境，使炎症反应陷入恶性循环，阻碍组织修复[4],[5]。同时，与糖尿病相关的慢性炎症状态和巨噬细胞功能障碍会降低成骨细胞的活性，显著延缓骨骼愈合[6],[7]。引导性骨骼再生（GBR）是治疗骨缺损的标准临床技术，其核心是使用屏障膜来隔离缺损部位，为新骨生长提供保护空间[8],[9]。目前，基于胶原的屏障膜（如Bio-Gide?）因其优异的生物相容性而在GBR手术中得到广泛应用[10]。然而，传统的胶原膜存在一些缺点，包括屏障功能不足、机械强度不够、降解过快以及缺乏抗菌和免疫调节能力。这些限制严重影响了骨骼再生的效果，尤其是在感染或糖尿病等复杂环境中，这些因素会极大地削弱GBR的效果[11],[12]。因此，迫切需要开发新型的GBR胶原膜，即使在这样的挑战性环境中也能保持稳定的屏障功能和强大的机械完整性，同时具备抗菌活性，并能够重塑具有抗炎和促骨生成效果的免疫微环境。

为了提高GBR膜的整体性能，研究人员探索了多功能复合材料和创新的结构设计。Janus膜就是一个很好的例子：其中一侧作为对软组织的坚固屏障，而另一侧则提供有利于骨细胞粘附和生长的表面[13],[14]。与传统胶原膜相比，Janus膜在体内表现出更优异的骨骼再生效果。这些发现表明，通过同时提供物理隔离和促进再生的界面，Janus膜可以在易感染或炎症的环境中实现更高效的骨骼修复[15],[16]。然而，大多数现有的GBR膜仅提供被动隔离，缺乏与免疫系统的主动互动，这在愈合条件受损时往往会导致修复效果不佳。因此，理想的GBR膜应结合高度完整的物理屏障和动态调节局部微环境的能力[17]。它不仅应能有效防止软组织细胞和病原体的渗透，还应通过控制释放抗菌因子和诱导有利的免疫反应来抑制感染和过度炎症[18],[19]。将这些功能整合到Janus膜的设计中，有望实现下一代GBR解决方案。

近年来，已经开发出多种制造技术来构建Janus膜的分层结构。其中，电化学沉积技术特别值得注意，因为它能够高效地将生物大分子组装成分层结构[20],[21]。这种方法可以快速、可控地构建从致密层到多孔层的梯度结构，从而精确调节膜的形态和性能[22]。同时，电化学沉积为将多个功能层整合到Janus膜中提供了灵活、可扩展的平台，并且非常适合工业规模生产[23],[24]。在骨缺损修复的背景下，植入后的即时感染控制和及时的炎症反应调节对于确保成功再生至关重要[25],[26]。研究表明，在受伤后的初期阶段（大约1-3天），巨噬细胞主要向促炎M1表型极化；而在4-7天左右，它们会转变为抗炎M2表型[27],[28],[29]。这种M1到M2的转变对骨骼再生至关重要。

鉴于此，我们在Janus膜的多孔修复层中加入了掺铜的羟基磷灰石（CuHA），以赋予其抗菌和促进愈合的功能。Cu²⁺可以替代Ca²⁺掺入羟基磷灰石（HA）的晶格中，并在基底降解过程中逐渐释放。这一层的多孔结构具有双重作用：首先，它增加了蛋白质的吸附并增强了材料的促骨生成性，从而促进骨细胞粘附[30]；其次，CuHA的加入使得Cu²⁺的释放具有程序性：早期的大量释放具有广谱抗菌效果，而在后期缓慢的持续释放则促进了新血管的形成并加速了新骨的生成[31],[32]。这种时空分阶段的释放策略满足了植入后立即抑制感染、随后建立促进再生的微环境的关键需求。此外，我们还在Janus膜系统中引入了原花青素（PA）作为生物活性因子。PA是一种天然多酚，具有显著的抗氧化和抗炎活性。研究表明，含有PA的支架可以抑制巨噬细胞向M1表型的极化，同时促进其向修复性M2表型的转变，从而有效调节局部免疫微环境[33],[34]。通过将PA加载到可降解的PLGA（聚乳酸-羟基乙酸）微球中，我们实现了双相释放机制：植入后立即的大量释放，随后是持续的释放。PA的早期释放可以缓解急性炎症损伤，并促使巨噬细胞向M2表型转变；随后的逐渐释放有助于维持长期的抗炎环境，进一步促进巨噬细胞的极化，从而支持组织再生。

基于这些概念，我们通过电化学沉积制备了一种多功能Janus双层胶原膜（记为CuHA/PA@PLGA/Col），实现了精确的分层结构。该膜由一个致密的屏障层（面向软组织）和一个多孔的修复层（面向骨缺损）组成。致密的屏障层防止了成纤维细胞和细菌的渗透，为骨缺损的愈合提供了封闭的空间；多孔的修复层则含有CuHA和PA负载的PLGA微球（PA@PLGA）的复合材料。这种设计实现了时间可控的治疗效果：Cu²⁺的初期释放具有强大的抗菌效果，并引发了早期的血管生成；随后的持续释放提供了长期的抗氧化和免疫调节效果，最终促进了有利于骨骼再生的微环境。我们系统地表征了CuHA/PA@PLGA/Col膜的形态、机械性能、降解行为和释放特性，并确认了其广谱抗菌效果以及清除活性氧（ROS）的抗氧化能力。体外实验表明，该膜具有良好的生物相容性，能够调节巨噬细胞向有利于愈合的M2表型的极化，促进血管内皮细胞活性，并增强骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化。在两个复杂缺损模型（感染性颅骨缺损和糖尿病性牙周缺损）中的体内评估进一步表明，与对照膜相比，CuHA/PA@PLGA/Col不仅提供了有效的软组织屏障，还积极调节了局部免疫环境，显著促进了新骨的再生。由于其精确设计的层状结构和可控的顺序释放机制，CuHA/PA@PLGA/Col实现了抗菌、促骨生成和免疫调节功能的协同作用，满足了修复复杂骨缺损的关键微环境要求。这一策略不仅提供了术后的即时感染保护，还在整个愈合过程中动态地塑造了有利于骨骼再生的免疫环境。此外，简单高效的电沉积工艺支持了其精确的结构制备和功能整合，并展示了其在多种组织再生场景中的广泛应用潜力（见图1）。

Janus胶原膜CuHA/PA@PLGA/Col的制备和表征

在本研究中，通过电沉积法制备了一种具有屏障层和修复层的Janus胶原膜（图1A）。具体来说，CuHA是通过先前报道的水热法合成的[35]。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，CuHA形成了规则的花状微球，具有松散的多孔结构（图S1），这与先前的报告一致。这种分层微/纳米结构显著增强了蛋白质的吸附和促骨生成性能

结论

本研究设计并制备了一种基于胶原的Janus膜（CuHA/PA@PLGA/Col），用于应对复杂病理环境中的骨骼再生挑战。该膜具有不对称的双层结构，包括一个电沉积的致密屏障层和一个多孔修复层。结果表明，CuHA/PA@PLGA/Col具有优异的机械性能、可控的降解特性、强大的抗氧化活性等

伦理声明

本研究严格遵守了所有相关的伦理规定。四川大学动物研究伦理委员会（批准编号20250707003）批准了所有动物实验程序。此外，华西口腔医院伦理委员会（参考编号WCHSIRB-D-2022-457）也批准了本研究。

CuHA/PA@PLGA微球的制备

CuHA是通过先前报道的水热法合成的[30]。PA@PLGA微球是通过水-油-水（W₁/O/W₂）双乳液法制备的

作者贡献声明

郭泰林：撰写、审稿与编辑、监督、资源提供、方法学设计。 李建树：撰写、审稿与编辑、监督、资源提供。 袁全：撰写、审稿与编辑、监督、资源提供。 常东彪：撰写初稿、数据可视化、验证、方法学设计、实验研究、数据分析。 谭欢：审稿与编辑、验证、资源提供、项目管理、资金争取。 李林珂：数据验证、方法学设计、实验研究。 翁杰：

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向相应作者索取。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（NSFC，项目编号32571563、22172120、823B2018）、四川省科技计划（2025YFHZ0233）以及成都市科技局项目（2024-YF05-00183-SN、2024-YF05-00178-SN）的支持。作者还感谢四川大学口腔疾病重点实验室在微CT分析方面的帮助。此外，作者感谢BioRender.com在图表制作中的协助。