通过实验方法和集成机器学习技术，优化Cuupriavidus necator菌体在应激条件下的生长状态，以最大化聚羟基丁酸（PHB）的积累量

《Bioresource Technology Reports》：Stress condition optimization for maximizing polyhydroxybutyrate accumulation in Cupriavidus necator via experimental and ensemble machine learning approaches

聚-β-羟基丁酸（PHB）的积累受培养基中碳（C）、氮（N）、磷（P）平衡的显著影响。研究通过125组全因子实验设计（C:5-25g/L，N:0.001-2.0g/L，P:6-10g/L），结合随机森林（RF）模型与差分进化（DE）算法，发现PHB积累随C升高而增强，受N抑制，在P浓度8-9g/L时达到最优。RF模型预测精度达R2=0.90±0.05，DE优化得到22.8g C/L、0.19g N/L、9.36g P/L的最佳条件，预测PHB产量0.87g/L与实验吻合。SHAP和LIME分析揭示了C的主导作用（>N,P），并解释了各营养阈值行为。RF-DE框架实现了数据驱动的可解释优化，为生物过程设计提供新范式。

　　

朴彩妍|沈敏圭|金世贤|河健秀|巴拉昌德拉兰·马纳瓦兰|白佳炫

韩国成均馆大学综合生物技术系，水原16419

摘要

聚羟基丁酸酯（PHB）是一种有前景的可生物降解聚合物，但其在大肠杆菌（Cupriavidus necator）中的积累受到培养基中碳（C）、氮（N）和磷（P）平衡的强烈影响，这些因素决定了PHB的积累量。通过使用5×5×5的全因子设计，建立了125种实验条件，碳浓度范围为5至25克/升，氮浓度为0.001–2.0克/升，磷浓度为6–10克/升，以系统地优化PHB的积累。PHB的积累量随着碳浓度的增加而增加，受到氮的抑制，并在磷浓度约为8–9克/升时达到最大值，此时磷酸盐代谢达到了有利于PHB积累的最佳平衡。应用了六种机器学习模型来预测非线性关系，其中随机森林（RF）模型的预测准确性最高（R² = 0.90 ± 0.05）。基于可解释人工智能（XAI）的Shapley Additive ExPlanations（SHAP）和Local Interpretable Model-agnostic Explanations（LIME）分析证实，碳对PHB积累的影响最大，其次是氮和磷，并阐明了每种营养物质的阈值行为。差分进化（DE）与RF模型结合，确定了最佳条件为22.8克/升的碳、0.19克/升的氮和9.36克/升的磷，预测的PHB积累量为0.87克/升，与实验结果和先前研究相当一致。RF–DE集成框架将实验数据与可解释的优化方法相结合，为PHB积累过程及其他生物过程的设计和控制提供了一种数据驱动的策略。

引言

由于管理不当和处置成本上升，塑料废物构成了严重的全球环境问题（Lhamo等人，2024年）。大部分塑料废物未被回收，最终进入垃圾填埋场或焚烧炉，导致海洋和土壤中的积累，有害化学物质长期泄漏，以及微塑料引起的生态扰动（Narancic和O'Connor，2019年）。为应对这些挑战，由微生物发酵产生的聚羟基丁酸酯（PHB）因其优异的生物降解性和可与聚丙烯相媲美的机械性能而受到广泛关注，适用于医疗保健、包装和农业等领域（Dalsasso等人，2019年；McAdam等人，2020年）。超过300种微生物可以合成PHB，包括几种代表性菌株，如大肠杆菌（Cupriavidus necator）、Alcaligenes属、Azotobacter属、Bacillus属和Nocardia属（McAdam等人，2020年）。其中，C. necator因能够利用各种碳源将其细胞干重的90%积累为PHB而被广泛研究（Dalsasso等人，2019年）。

最近关于微生物PHB生产的研究集中在通过使用低成本碳源和工艺优化来降低生产成本和提高生产力（Zhang等人，2022年）。C. necator从各种碳源（包括食物废物、木质纤维素生物质甚至无机碳源如二氧化碳（CO₂））中表现出高PHB积累效率，从而验证了使用低成本底物生产PHB的可行性（Zhang等人，2022年）。此外，还研究了反应器操作策略，如底物预处理、多阶段进料和分批操作等，以优化底物利用并分离细胞生长和PHB积累，显著提高了PHB的生产力（Azizi等人，2017年；Mozumder等人，2014年；Zhang等人，2022年）。代谢工程也取得了实质性进展，努力将代谢流重定向到PHB合成（Lee等人，2025年；Lin和Ng，2025年）。然而，碳源成本与发酵生产力之间的不平衡仍然是商业化的主要障碍，这突显了持续优化和工艺开发的必要性（Kachrimanidou等人，2021年）。

为了提高PHB的生产力，营养限制被作为一种关键策略，其中碳（C）、氮（N）和磷（P）的平衡尤为重要（Aramvash等人，2015年；Ron?o?ová等人，2022年）。在氮和磷限制下，过量的碳可以促进NADPH的再生，增加乙酰乙酰辅酶A还原酶（PhaB）的活性，并将乙酰辅酶A导向PHB生物合成途径，从而增强PHB的积累（Lee，1996年；Schubert等人，1988年）。虽然统计方法如响应面方法（RSM）和中心复合设计（CCD）已被广泛用于优化营养条件，但它们在捕捉非线性动态和复杂变量相互作用方面仍存在局限性（Aramvash等人，2015年；Ron?o?ová等人，2022年）。最近，机器学习（ML）作为一种有前景的替代方法出现，因其预测准确性和处理多变量数据集的能力，但在PHB生产中的应用仍然有限，主要限于单一模型研究，缺乏系统的模型比较（Kumari等人，2019年；Laurence等人，2024年；Lhamo和Mahanty，2024年；Lhamo等人，2024年）。为了克服这些缺点，本研究结合了多种ML模型和可解释人工智能（XAI）。XAI提供了可解释的框架，有助于理解模型决策过程，从而提高透明度，并深入洞察PHB生产过程中的多变量相互作用（Dwivedi等人，2023年）。

在这项研究中，我们通过结合125种营养条件的实验评估和基于ML的预测建模，旨在最大化C. necator中的PHB生产力。研究了PHB的积累情况，以确定其是否不仅受个别营养素绝对水平的影响，还受它们的非线性和交互作用的影响。利用得到的数据集，应用了六种ML模型来预测生产力并确定最佳参数。为了提高可解释性，进一步使用XAI技术来解释碳、氮和磷浓度的相对贡献，支持一种数据驱动的培养策略，以提高PHB积累效率并克服纯实验方法的局限性。因此，提出了一种集成的随机森林–差分进化（RF–DE）框架，用于营养条件的可解释优化，提供了一种可转移的数据驱动方法，适用于生物过程优化。

章节摘录

细菌培养

C. necator（KCTC 22469）在30°C下于溶原质肉汤（LB）中预培养，并以200 rpm的速度摇动。随后在含有10克/升果糖的最小培养基（MM）中传代两次，然后在相同的条件下在添加了10克/升醋酸的MM中再传代三次，每次48小时（Zhang等人，2021年）。MM（每升）的组成包括9克Na₂HPO₄·12H₂O、1.5克KH₂PO₄、1.0克（NH₄)₂SO₄、0.2克NaHCO₃和1毫升微量矿物质溶液（Li等人，2018年）。微量矿物质溶液

C:N:P比例对PHB生产的影响

在测试的125种组合中，PHB浓度范围为0.02至1.00克/升，随着碳浓度的增加而一致增加（图1和表S1；见补充材料）。在25克/升的碳、0.001克/升的氮和9克/升的磷条件下，实现了最高的PHB浓度（1.00 ± 0.07克/升），表明高碳含量与低氮含量相结合显著促进了生产（Doi等人，1988年；Lee，1996年）。相比之下，在低碳浓度（5–10克/升）下，PHB浓度

结论

RF和DE的结合使得基于实验验证数据开发出一个可解释的PHB积累优化框架。RF模型实现了高预测准确性（R² = 0.90 ± 0.05），基于DE的全局优化确定了最佳条件为22.8克/升的碳、0.19克/升的氮和9.36克/升的磷，预测的PHB积累量为0.87克/升，与实验结果相当一致，尽管存在轻微偏差。SHAP和LIME分析提供了

CRediT作者贡献声明

朴彩妍：撰写——原始草稿、方法论、正式分析、概念化。沈敏圭：研究、正式分析、数据管理。金世贤：验证、方法论、研究、数据管理。河健秀：验证、研究。巴拉昌德拉兰·马纳瓦兰：撰写——审阅与编辑、验证。白佳炫：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了韩国政府（MSIT）资助的韩国国家研究基金会（NRF）的资助（编号：RS-2025-16068491和RS-2025-02253004）。