《Biosensors and Bioelectronics》：Clamp the LAMP: a photoelectrochemical platform for
KRAS mutation detection via wild-type blocking
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KRAS突变检测新方法：结合C-LAMP抑制野生型扩增与PEC单线态氧驱动实现高灵敏检测，检测限达35 copies/μL，变体频率最低4.8%，验证与主流测序技术一致，适用于分散式临床诊断。
J. Strmiskova|A. Valverde|L. Moranova|J. Arnouts|F. Zavadil-Kokas|S. Koljenovic|K. Zwaenepoel|T. Vandamme|M. Bartosik|K. De Wael
应用分子肿瘤学研究中心（RECAMO），马萨里克纪念癌症研究所，65653 布尔诺，捷克共和国
摘要
KRAS突变是结直肠癌、肺癌和胰腺癌中最常见的致癌变异之一，但在野生型（WT）背景占主导的情况下，其检测仍具有分析上的挑战性。本文介绍了一种光电化学（PEC）基因分型平台，该平台结合了夹阻抑制的环介导等温扩增（C-LAMP）和无酶单线态氧（1O2）驱动的PEC转导技术，以实现选择性KRAS突变检测。锁定核酸（LNA）夹探针在等温扩增过程中选择性地抑制WT序列的扩增，从而富集突变等位基因，并以高选择性区分单核苷酸变异（SNV）。扩增产物通过可见光诱导的1O2氧化还原循环被磁捕获并转化为光电流，消除了对酶的依赖并减少了背景干扰。C-LAMP/PEC平台的检测限为35个拷贝/μL（58 aM），在异质性突变/WT基因组DNA混合物中可检测到的最小变异等位基因频率（VAF）为4.8%。在癌细胞系和患者来源的新鲜冷冻组织中验证了其分析性能，与Nanopore测序和液滴数字PCR（ddPCR）的结果完全一致（n = 16）。这项工作提出了一种稳健且模块化的PEC生物传感策略，将分子WT抑制技术与无酶光电化学相结合，为临床相关的KRAS突变分析提供了一种经济可行且仪器要求较低的方法，适用于分散式检测。
引言
KRAS（Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因同源物）基因突变是人类癌症中最常见的致癌变异之一，也是关键的治疗靶点（Yang等人，2023年）。KRAS与NRAS和HRAS共同编码一种小的GTP结合蛋白，该蛋白调节Ras/Raf/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，这是细胞增殖和存活的核心介质。致癌KRAS突变会破坏内在的GTP酶活性，导致持续激活和肿瘤发生（Jancik等人，2010年）。这类突变大约发生在23%的成人癌症中，主要表现为密码子12和13处的单核苷酸变异（SNV）。临床相关的变异如G12C和G12V在结直肠癌（CRC）、非鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）和胰腺导管腺癌（PDAC）中较为普遍，这些变异与不良预后和治疗反应降低相关（Lee等人，2022a；Meng等人，2021年；Tan和Tan，2022年）。除了预后意义外，KRAS突变状态还决定了患者是否适合接受靶向治疗，包括EGFR抑制剂以及目前正在临床试验中的泛KRAS抑制剂和等位基因特异性抑制剂（Biller和Schrag，2021年；Fu等人，2021年；Janes等人，2018年；Negri等人，2022年；Strickler等人，2023年；Zhao等人，2017年）。
这些因素突显了准确且易于使用的KRAS基因分型技术的必要性。聚合酶链反应（PCR）和下一代测序（NGS）仍然是突变检测的临床标准方法，但它们的广泛应用受到仪器要求、多步骤工作流程以及对集中式设施和训练有素人员的依赖限制（Arnouts等人，2025年；Gilson等人，2019年；Sherwood等人，2017年）。改进的基于PCR的策略，包括肽核酸（PNA）阻断剂、在较低变性温度下的共扩增（COLD-PCR）和多重荧光检测，提高了等位基因的富集度和分析灵敏度，但操作仍较为复杂（Carotenuto等人，2012年；Laosinchai-Wolf等人，2011年；Oh等人，2010年）。因此，等温扩增技术（IATs）因其能在恒定温度下运行并减少仪器需求而受到越来越多的关注。诸如环介导等温扩增（LAMP）、滚环扩增（RCA）和重组酶聚合酶扩增（RPA）等方法已被用于KRAS或其他SNV的检测，通常与生物传感接口结合使用以简化工作流程并缩短检测时间（He等人，2025年；Islam等人，2025年；Ji等人，2025年；Lazaro等人，2022年；Lee等人，2022b年；Li等人，2022年；Martorell等人，2019年；Moranova等人，2024年；Ondraskova等人，2023年；Sebuyoya等人，2025年；Zhou等人，2022年）。其中，LAMP具有高扩增效率、稳健性和与简化硬件的兼容性，使其适用于分散式分子诊断。
尽管取得了这些进展，但由于野生型（WT）序列在临床样本中通常占99%以上，KRAS SNV的检测仍然具有挑战性。这种WT背景在低变异等位基因频率（VAF）下严重降低了检测的特异性，限制了罕见突变等位基因的可靠区分以及基于IAT的生物传感器的临床应用。锁定核酸（LNA）修饰的探针改善了错配歧视能力（Choate等人，2024年；Moranova等人，2024年），但在等温条件下有效抑制WT序列仍然困难。与此同时，光电化学（PEC）生物传感作为一种强大的核酸检测技术应运而生，它结合了高灵敏度、低背景和与微型化仪器的兼容性。单线态氧（1O2）驱动的PEC方法利用可见光激活光敏剂产生活性氧物种，触发如对苯二酚（HQ）等介质的氧化还原循环，从而实现无酶光电流转导（Trashin等人，2017年）。虽然这一概念相对于酶促检测系统具有更好的稳定性和更低的试剂成本，但之前的1O2驱动PEC研究主要使用合成寡核苷酸进行，并且缺乏系统的生物学验证，尚未系统地应用于临床相关的KRAS SNV基因分型（Daems等人，2024年；Shanmugam等人，2024年；Stratulat等人，2025年）。
本文介绍了一种光电化学平台，该平台结合了夹阻抑制的LAMP（C-LAMP）和1O2驱动的PEC检测，用于选择性KRAS基因分型。该系统使用LNA修饰的夹探针在等温扩增过程中阻断WT序列，从而富集突变等位基因，并实现单核苷酸区分。扩增产物被捕获在经过LNA修饰的突变特异性捕获探针功能化的磁微珠上，并通过可见光驱动的1O2氧化还原反应转化为稳定的光电流。通过探针重新设计，该架构具有序列适应性，为KRAS突变检测提供了一个无酶且灵活的分析框架，具有分散式实施的潜力。
实验部分
有关仪器、电极配置、磁珠、试剂和溶液、寡核苷酸序列以及全面实验程序（包括C-LAMP方案、1O2驱动PEC平台的制备、癌细胞系和患者来源组织的分析、实时C-LAMP方案和统计分析）的详细信息，请参见补充信息。
所有涉及人类材料的程序均按照机构规定进行
C-LAMP/1O2驱动PEC平台的设计和工作原理
所提出的生物传感平台结合了C-LAMP和无酶1O2驱动的PEC检测，以实现KRAS基因中的SNV区分（图1）。寡核苷酸序列的完整列表见表S1。在扩增过程中，两个LNA修饰的夹探针（CL1和CL2）与KRAS WT序列的密码子12和13处的突变热点杂交。LNA夹探针的高双链稳定性选择性地抑制了与WT模板完全匹配的聚合酶延伸
结论
本研究介绍了一种光电化学生物传感平台，该平台结合了夹阻抑制的环介导等温扩增（即C-LAMP）和1O2驱动的PEC转导，用于选择性检测KRAS突变。通过结合LNA介导的野生型抑制和突变特异性PEC杂交，该平台建立了一种两阶段的分子识别机制，提高了在复杂基因组DNA背景中的单核苷酸区分能力。
实验伦理
所有实验均符合机构指南和《赫尔辛基宣言》的伦理标准。
生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作时，作者使用了ChatGPT和PaperPal来提高文本的可读性。这些AI工具生成的所有建议都经过了作者的仔细审查和编辑，作者对文章的最终内容负全责。
CRediT作者贡献声明
Johana Strmiskova：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。Karolien De Wael：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、资金获取。Filip Zavadil-Kokas：验证、研究。Jorine Arnouts：撰写 – 审稿与编辑、验证、研究、数据管理。Ludmila Moranova：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学数据可用性声明
支持本研究的所有数据均包含在论文及其补充信息中。如需额外原始数据，可向相应作者索取。
数据可用性声明
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? 作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。致谢
本工作得到了跨大学特别研究基金（iBOF/23/030）的支持。还感谢捷克卫生科学基金会（编号：25-15990S）的财政支持，该项目SALVAGE（OP JAC；注册号：CZ.02.01.01/00/22_008/0004644）得到了欧盟和捷克共和国国家预算、捷克卫生研究委员会（编号：NU23J-08-00006）以及BBMRI.cz（编号：LM2023033）和MH CZ-DRO（MMCI，00209805）的联合资助。A.V.还感谢弗兰德斯研究基金会的资助。
