《Brain Research》：Sodium fluoride exposure reduced cognitive impairment via disorders synaptic protein expression and neuronal development in mice brain
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氟暴露通过抑制突触相关蛋白（PSD95、GAP43、DBN）表达和破坏神经突触结构引发小鼠认知功能障碍，体外实验证实氟化物抑制HT-22细胞增殖并改变形态。
陈玲莉|王睿|贾鹏焕|江倩|安思源|尹志宏|胡东方|宁红梅|葛亚明
河南科技大学动物科学与兽医医学院，中国河南省新乡市453003
摘要
作为一种环境污染物，氟化物以多种形式广泛存在于自然环境中，而饮用水是人类和动物接触氟化物的主要途径。氟化物暴露后，可能会对中枢神经系统造成结构损伤，从而导致认知功能障碍。然而，氟化物引起认知障碍的机制尚不明确。本研究建立了氟化物暴露的小鼠模型和HT-22细胞模型，以探讨氟化物的神经毒性机制。体外实验中，CCK-8检测结果显示随着氟化物浓度的增加，HT-22细胞的存活率下降，细胞形态也出现异常。激光共聚焦显微镜观察发现，随着氟化物浓度的升高，轴突和树突的数量减少。Western blot结果显示，氟化物处理组中突触相关蛋白和细胞骨架相关蛋白的表达水平降低。体内实验中，氟化物处理组的小鼠体重和脑重均低于对照组。步态测试表明，氟化物处理组小鼠的认知能力显著下降。Western blot结果显示，低浓度氟化物处理组中突触相关蛋白和细胞骨架相关蛋白的表达水平低于对照组，qRT-PCR结果显示PSD95的表达显著降低。这些结果表明，氟化物引起的认知障碍与突触形态损伤及突触蛋白表达异常有关。
引言
氟化物（F）作为一种活性非金属元素，在自然界中主要以不同化合物的形式存在（Zhang等人，2019年）。在低浓度下，氟化物是人体所需的微量元素，可以预防龋齿的发生（Indermitte等人，2009年；Wang等人，2019年）。通常情况下，地表水中的氟化物浓度低于1.0毫克/升，但由于地下水与大量萤石接触，其浓度会升高（Ferreira等人，2010年）。饮用水是氟斑牙患者接触氟化物的主要来源（Flores-Méndez等人，2014年）。长期过量接触氟化物会导致人类和动物出现严重的地方性氟中毒（Wang等人，2017年；Wei等人，2019年）。研究表明，随着饮用水中氟化物浓度的增加，其他疾病也会逐渐恶化（Indermitte等人，2009年）。有毒氟化物的积累会损害人类和动物的中枢神经系统结构和功能（Flores-Méndez等人，2014年；Zhou等人，2020年），表现为所有脑结构的永久性损伤、行为异常和认知功能障碍（Dec等人，2017年）。数据表明，氟化物在脑中的沉积可能导致学习能力下降，大量氟化物的积累还会导致记忆力减退（Niu等人，2018年）。因此，生活在高氟化物地区的人的智商得分低于生活在低氟化物地区的人（Razdan等人，2017年；Choi等人，2012年）。因此，氟化物对中枢神经系统的神经毒性引起了广泛关注。
正常的神经突触功能及相关行为表现依赖于关键突触结构和功能蛋白的协调表达，包括Drebrin（DBN）、突触后密度蛋白95（PSD95）和轴突生长相关蛋白43（GAP43）——这些是本研究关注的突触发育、可塑性和功能完整性的核心标志物。DBN是一种存在于许多脑神经元中的细胞骨架相关蛋白，参与突触可塑性的调节（Liu等人，2017年；Willmes等人，2017年）和记忆形成（Takizawa等人，2012年；Ketschek等人，2016年）。一些研究表明，DBN在轴突分支初期参与肌动蛋白和微管细胞骨架的协调（Ketschek等人，2016年）。慢性神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和唐氏综合征）患者的脑组织中DBN的表达水平降低（Chimura等人，2015年）。神经细胞损伤模型显示，降低海马区初级神经元的DBN表达水平会减少树突棘的密度和宽度，从而降低信息传递效率（Chimura等人，2015年）。PSD95是一种关键的突触后支架蛋白，对突触发育、信息传递和突触重塑至关重要（Mardones等人，2019年；Kneussel和Hausrat，2016年）。PSD95在成年小鼠海马区新生神经元的成熟过程中起着重要作用（Mardones等人，2019年）。多项研究表明，PSD95蛋白表达的降低与中枢神经系统的损伤程度呈正相关（Hyun等人，2022年）。在小鼠模型中，脑组织中PSD95的mRNA表达下降伴随着认知能力的下降（Liu等人，2022年）。GAP43通常与轴突可塑性和再生相关（Hung等人，2016年），该蛋白是神经生长和发育的良好指标。在神经细胞修复模型中GAP43的表达水平升高（Pattarachotanant等人，2022年），而在损伤小鼠模型中其mRNA水平降低（Chen等人，2022年）。因此，PSD95和GAP43可以作为神经细胞正常生长和发育的指标，对提高认知能力至关重要。
本研究旨在探讨氟化物暴露对体内和体外神经功能的影响。结果表明，氟化物暴露会损害突触相关蛋白和细胞骨架相关蛋白，为氟化物引起的神经毒性提供了新的研究方向。
化合物和试剂
本研究使用了氟化钠（天津晶贝，中国）、Trizol试剂（Invitrogen，美国）、高容量cDNA逆转录试剂盒（TransGen，中国）、DMEM/高糖培养基和MEM培养基（Cytiva，美国）。胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素、细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、RIPA蛋白裂解液、广谱蛋白酶抑制剂混合物（不含EDTA）、磷酸酶抑制剂混合物（100倍）、PMSF溶液和SDS上样缓冲液均购自Solarbio（北京，中国）。
小鼠氟化物暴露模型的建立
NaF暴露小鼠的尿液氟化物含量和毒性表型
动物实验的结果如图1所示。与对照组相比，小鼠尿液中的氟离子浓度显著升高（P<0.001），且这种升高与饮用水中的氟化物暴露剂量呈正相关（图1A）。测量了小鼠的体重，三组小鼠的平均体重分别为38.681±0.06克（对照组）、36.850±0.22克（50毫克/升）和31.475±0.21克（100毫克/升）。平均错误时间为13.4±0.29秒（对照组）。
氟化物抑制HT-22细胞的增殖
为了验证氟化物的神经毒性，我们选择了HT-22细胞来检测细胞活力和细胞毒性。CCK-8实验的结果如图3所示。随着暴露剂量和时间的增加，HT-22细胞的存活率逐渐下降（图3A–3C）。这些数据表明，氟化物暴露以时间和剂量依赖的方式抑制了HT-22细胞的增殖。
讨论
氟化物是一种广泛存在于自然界中的微量元素，被应用于多个生活领域。人体对氟化物的吸收主要取决于饮用水、食物和空气中的氟化物含量（Dec等人，2017年；Perumal等人，2013年）。过量接触氟化物可导致多种类型的氟中毒，如龋齿和骨骼氟中毒（Liu等人，2015年），还可能引发胃肠道问题和癌症（Jagtap等人，2012年）。
结论
本研究证实，氟化物暴露会降低细胞活力，改变细胞形态，并抑制突触蛋白（包括DBN、PSD95和GAP43）的表达，从而引发认知功能障碍；这些发现揭示了氟化物对突触的毒性作用，同时也表明长期氟化物暴露可能以暴露浓度和突触标记物类型依赖的方式影响神经突触功能的特定方面。
伦理批准声明
所有涉及小鼠的实验均获得了河南科技大学动物伦理委员会的批准，并按照其指南进行（批准编号：2020HIST014）。
作者贡献声明
陈玲莉：数据整理、概念构思。王睿：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、监督、软件使用、资源管理、项目协调、方法设计、实验实施、数据分析、概念构思。贾鹏焕：数据整理。江倩：方法设计、实验实施。安思源：实验实施。尹志宏：项目协调、方法设计。胡东方：监督、资源提供。宁红梅：方法设计、实验实施。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
