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凝集素-糖链相互作用研究新方法：通过生物素标记的糖链-金纳米颗粒（Biotin-SGNPs）与链霉亲和素功能化磁珠（streptavidin-MBs）的复合系统，成功实现了单聚体和多聚体凝集素的分离与分析。该方法突破传统技术对单子体凝集素检测的局限，可高效捕获血清和组织匀浆中的凝集素，并通过SDS-PAGE验证其特异性。研究揭示了纳米颗粒表面PEG链长度对磁分离效率的关键影响，为凝集素功能解析和生物样本纯化提供了创新工具。
村田幸树 | 加藤健太郎 | 黑木百合 | 宇野英明 | 若尾雅弘 | 森田康夫 | 新地宏之
日本鹿儿岛大学理学工学研究科工程、化学与生物技术专业，Korimoto 1-21-40，鹿儿岛 890-0065
摘要
凝集素通过特异性识别糖链结构，在细胞间识别、免疫反应和病原体感染等各种生物过程中发挥着关键作用。因此，阐明凝集素与糖链的相互作用对于理解其生理和病理功能至关重要。此前，我们开发了固定了糖链的金属纳米颗粒，作为分析凝集素-糖链相互作用和分离凝集素的工具。这些纳米颗粒会与具有多个糖链结合位点的多亚基凝集素聚集，从而便于凝集素的分析和分离。然而，这种方法不适用于不诱导聚集的凝集素（如单亚基凝集素）。为了解决这一限制，我们建立了一种利用生物素标记的固定糖链的金纳米颗粒和链霉亲和素功能化磁珠的凝集素拉下法。该技术能够有效分析单体和多聚体凝集素的糖链相互作用，并已证明可以从血清和组织匀浆等复杂生物样本中捕获凝集素。因此，这种凝集素拉下法是研究凝集素-糖链相互作用的宝贵方法，并为从生物样本中分离凝集素提供了可能性。
引言
凝集素是一种结合糖链的蛋白质，在细胞间识别、信号转导和免疫反应等多种生物过程中发挥着关键作用[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。细胞表面的凝集素受体介导细胞间的相互作用以及对外来物质的识别。例如，C型凝集素受体可以结合微生物上的特定糖链，从而促进其摄取并触发免疫反应[1]、[2]。细胞内的凝集素调节蛋白质折叠、运输和降解等过程[3]、[4]、[5]、[6]。位于内质网的钙网蛋白和钙网蛋白样蛋白可以与新生蛋白质上的特定糖链结合，确保蛋白质合成过程中的正确折叠和质量控制[5]、[6]。此外，凝集素在病原体感染中也起着重要作用[7]、[8]。例如，流感病毒通过其表面的血凝素与宿主细胞上的唾液酸结合来启动感染[9]。最近，凝集素作为潜在的抗病毒和抗菌剂[10]、[11]以及抗癌药物的载体[12]而受到关注。因此，识别凝集素并阐明其与糖链的相互作用对于理解其生理和病理功能及其潜在应用至关重要。然而，由于传统分析和分离技术的局限性，分析凝集素-糖链结合特性以及从复杂生物样本中分离凝集素仍然具有挑战性。分析凝集素-糖链相互作用和分离凝集素的一个主要障碍是单个糖链与凝集素之间的亲和力通常较弱。为了克服这一固有限制，研究了固定了糖链的纳米颗粒（SNPs），因为密集功能化的糖链纳米颗粒通过糖链聚集效应表现出增强的凝集素结合亲和力[13]、[14]、[15]、[16]。在我们的研究中，我们使用金纳米颗粒（GNPs）或量子点作为工具来研究凝集素-糖链相互作用[17]、[18]、[19]。这些纳米颗粒可以通过具有多个糖链结合位点的多亚基凝集素的交联和聚集作用，实现凝集素-糖链相互作用的可视化以及凝集素的分离。我们还证明了该方法可以用于从血清和组织匀浆等复杂生物样本中捕获凝集素。因此，这种凝集素拉下法是研究凝集素-糖链相互作用的宝贵方法，并为从生物样本中分离凝集素提供了可能性。
材料
生物素衍生物；Biotin-PEG3-TA（Biotin-dPEG3-lipoamide）和Biotin-PEG11-TA（Biotin-dPEG11-lipoamide）购自Vector Laboratories（美国加利福尼亚州纽瓦克）。糖链衍生物Galβ1-4Glc-TA、Manα1-6Glc-TA、SAα2-3Galβ1-4Glc-TA和PEG3-TA在实验室中合成[18]、[22]。四氯金(III)酸钠和硼氢化钠购自Nacalai Tesque（日本京都）。Visking透析管（分子量截留范围：12,000–14,000）购自AS ONE（大阪）。
Biotin-SGNPs的制备和表征
图1展示了使用Biotin-SGNPs和链霉亲和素功能化磁珠（streptavidin-MBs）的凝集素拉下实验示意图。在该实验中，结合到Biotin-SGNPs上的凝集素通过链霉亲和素功能化磁珠被分离，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析。生物素通过聚乙二醇（PEG）间隔物与硫辛酸（TA）结合，从而将其固定在GNPs上（分别标记为Biotin-PEG3-TA和Biotin-PEG11-TA；图2）。为了防止糖链部分或核心GNPs与生物素结合之间的潜在干扰……
结论
我们开发了一种使用Biotin-SGNPs和链霉亲和素功能化磁珠（streptavidin-MBs）的凝集素拉下方法，用于分析凝集素-糖链相互作用和分离凝集素。结果表明，用于Biotin-SGNPs生物素标记的连接长度是实现与链霉亲和素功能化磁珠高效磁分离的关键因素，该方法能够分析单体和多聚体凝集素的相互作用。此外，Biotin-SGNPs成功检测到了……
CRediT作者贡献声明
宇野英明：撰写、审稿与编辑、资源提供。黑木百合：撰写、审稿与编辑、实验研究。森田康夫：撰写、审稿与编辑、方法学设计。加藤健太郎：撰写、审稿与编辑、方法学设计。村田幸树：撰写初稿、验证、实验研究。新地宏之：撰写、审稿与编辑、项目监督、方法学设计、实验研究、资金申请、概念构思
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
资助
本工作部分得到了日本长崎大学热带医学研究所热带疾病联合使用/研究中心（2024-Ippan-02）和长崎大学青年研究员支持计划的支持。
利益冲突声明
本工作部分得到了日本长崎大学热带医学研究所热带疾病联合使用/研究中心（2024-Ippan-02）和长崎大学青年研究员支持计划的支持。我确认本手稿不存在其他利益冲突，且本工作未受到可能影响其结果的任何重大财务支持。
