萨萨萨波根宁（Sarsasapogenin）通过双重抑制RIPK1介导的坏死性凋亡（necroptosis）和焦亡（pyroptosis）来改善阿尔茨海默病（Alzheimer's disease）的症状

阿尔茨海默病（AD）治疗新策略：天然产物Sarsasapogenin通过抑制RIPK1同时阻断坏死性和炎症性细胞死亡机制，改善AD模型小鼠认知功能与脑病理特征。研究采用BLI、CETSA和DARTS证实Sar高亲和力结合RIPK1（KD=435nM），抑制RIPK1磷酸化及下游信号通路，在5×FAD小鼠中显著减少Aβ沉积、降低神经炎症和细胞死亡标志物，验证其作为新型RIPK1抑制剂的多靶点治疗潜力。

　　

郭玉杰|李晓鹏|陈月|李玉婷|程青梅|江永国|田世教|袁炳焕|刘艳|胡宏|李胜红

中国西南中医药资源国家重点实验室，中医药与药学创新研究院，成都中医药大学医学技术学院，成都611137，中国

摘要

萨萨萨波根宁（Sar）是一种从Anemarrhena asphodeloides中提取的天然生物活性甾体皂苷，在阿尔茨海默病（AD）的临床前模型中表现出显著的神经保护作用。然而，其具体作用机制，尤其是在调节受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）介导的坏死性凋亡和焦亡方面的机制，仍需进一步研究。本研究旨在通过靶向RIPK1（程序性细胞死亡的关键调节因子）来探讨Sar在AD中的治疗潜力。我们使用生物层干涉测量法（BLI）、细胞热位移测定法（CETSA）和药物亲和力响应目标稳定性测定法（DARTS）确认了Sar与RIPK1的结合。在体外实验中，我们通过Western blotting、免疫荧光和细胞因子测定法评估了Sar对SH-SY5Y神经母细胞瘤和BV2小胶质细胞中RIPK1激活、坏死性凋亡和焦亡的影响。在体内实验中，我们在5×FAD转基因小鼠模型中评估了Sar的治疗效果，通过Morris水迷宫行为分析和脑组织病理学评估来验证其疗效。Sar显示出与RIPK1的强结合（K_D = 435 nM），并增强了其热稳定性和抗蛋白水解降解能力。Sar处理显著抑制了神经元和小胶质细胞中的RIPK1磷酸化以及下游的坏死性凋亡和焦亡信号通路。在5×FAD小鼠模型中，Sar显著改善了空间记忆表现，减少了β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块的沉积，并降低了大脑皮层和海马区的神经炎症和坏死性凋亡标志物。Sar是一种有前景的天然RIPK1抑制剂，能够同时缓解坏死性凋亡和焦亡这两种AD的关键病理过程。这些发现表明，Sar可能通过调节与神经退行性病变相关的多种途径，成为一种新型的AD疾病修饰治疗手段，为天然产物在AD治疗中的潜力提供了新的见解。

引言

AD是一种进行性神经退行性疾病，主要特征是认知能力逐渐下降[1]、[2]、记忆力丧失[3]和行为异常[4]。目前全球约有5000万人患有AD，随着人口老龄化，预计到2050年这一数字将增加到1.52亿[5]。AD的发病机制极其复杂，尚未完全明了。现有的治疗策略主要集中在缓解症状上，目前尚无能够阻止或逆转疾病进展的药物。传统的AD研究主要集中在β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块的异常积累[6]和tau蛋白的过度磷酸化[7]、[8]上，这些因素会引发神经元损伤[9]、突触丢失[10]、[11]和神经炎症[12]、[13]，最终导致认知能力下降。然而，最近的研究表明，AD的病理进展不仅与Aβ沉积和tau蛋白过度磷酸化有关，还与程序性细胞死亡（包括坏死性凋亡[14]、[15]和焦亡[16]密切相关。值得注意的是，作为炎症性细胞死亡机制的坏死性凋亡和焦亡[17]、[18]，已成为AD研究中的关键领域。

在这些细胞死亡途径中，受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）在多种形式的程序性细胞死亡中起着核心作用[19]。RIPK1通过其激酶活性调节细胞死亡的关键步骤。在坏死性凋亡途径中，其激酶活性直接启动信号传导并控制该途径的激活和进展；在焦亡途径中，其激酶活性参与与炎症性细胞死亡相关的信号传导，并间接调节焦亡的发生和发展，从而对这两种途径的关键步骤起到调节作用[20]、[21]。在AD病理中，RIPK1信号通路的激活会促进神经元坏死和小胶质细胞焦亡，加剧病理损伤。RIPK1与受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）相互作用，磷酸化混合谱系激酶结构域样蛋白（pMLKL），激活坏死性凋亡途径[22]；在焦亡过程中，RIPK1与caspase-4/5/11和Gasdermin D（GSDMD）合作，间接介导细胞裂解并释放炎症因子如白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）[23]、[24]。RIPK1还可以与NOD样受体吡啉结构域含有3（NLRP3）相互作用，间接促进炎症因子的释放[25]、[26]，放大神经炎症反应[27]。这些发现表明，RIPK1在AD的神经炎症中起着重要作用，是一个潜在的治疗靶点。然而，针对RIPK1信号通路的治疗研究仍处于早期阶段。现有的RIPK1抑制剂（如Necrostatin-1（Nec-1）已被证明可以减少Aβ积累[28]、缓解神经炎症[29]并改善AD模型中的认知功能[30]、[31]，但其临床应用受到药代动力学不佳和脱靶效应的阻碍[32]。因此，寻找新的RIPK1抑制剂，特别是来自天然产物的抑制剂，已成为AD药物开发的重要方向。

天然产物，尤其是传统草药，由于其多样的化学结构和广泛的生物活性，已成为新型药物发现的重要来源。Anemarrhena asphodeloides Bunge这种传统中药因其抗炎[33]、抗氧化[34]和提高认知能力的特性而受到关注。其主要活性成分Sar因其广泛的药理作用而受到广泛研究。最近的研究表明，Sar及其衍生物sarsasapogenin-AA13能够增强胶质细胞清除Aβ的能力，为其在AD治疗中的潜力提供了实验证据[36]。此外，Sar衍生物还因其抗氧化和神经保护作用而受到关注[37]，能够减轻氧化应激（神经退行性疾病的关键因素）并减少Aβ聚集[38]，这是AD的标志性病理特征。这些作用有助于改善临床前模型中的认知功能。除了其神经保护作用外，Sar还表现出显著的抗炎特性。研究表明，Sar不仅可以改善认知功能并具有抗炎作用[33]，还能抑制肿瘤生长[39]，并在治疗包括AD在内的多种疾病中显示出潜力。它调节炎症途径，包括NLRP3炎性体和相关促炎细胞因子，这些在AD相关的神经炎症中起着关键作用[40]。Sar的抗炎作用与其改善神经元功能的能力相结合，使其成为开发AD和其他神经退行性疾病治疗策略的强大候选者。尽管有这些有希望的发现，但Sar在AD中发挥作用的精确机制——特别是它是否通过调节RIPK1信号通路来控制神经炎症和细胞死亡（如坏死性凋亡和焦亡）——仍有待进一步研究。全面了解这些机制将有助于深入理解Sar在AD治疗中的分子作用，并为其临床应用奠定理论基础。

AD的特点是一个复杂的病理网络，针对单一途径的治疗（例如，仅清除Aβ或抑制tau蛋白磷酸化）往往效果有限。这部分是因为这些方法未能充分解决由程序性细胞死亡驱动的炎症和神经元丢失的级联反应。RIPK1是坏死性凋亡和焦亡之间的关键调节节点，使其成为同时干预这两种炎症性细胞死亡过程的独特靶点。我们提出一个核心假设：通过直接抑制RIPK1的下游坏死性凋亡途径和间接抑制焦亡途径，药理学抑制RIPK1可能打破AD中的神经炎症和神经元死亡的恶性循环，从而比单一途径干预产生更全面的神经保护效果。本研究旨在验证这一假设，即新型天然RIPK1抑制剂Sar通过这种“双重抑制”机制（直接抑制坏死性凋亡和间接抑制焦亡）改善AD病理。与大多数针对Aβ或单一细胞死亡途径的现有策略不同，针对RIPK1的双重抑制策略作用更为上游，为AD的多维损伤轴提供了更为综合的方法。我们使用5×FAD转基因小鼠模型来评估Sar是否靶向并抑制RIPK1，从而直接抑制神经元坏死性凋亡并间接调节小胶质细胞焦亡，最终改善认知功能和神经病理。我们的发现表明，Sar靶向RIPK1，直接抑制坏死性凋亡途径并间接抑制焦亡途径，为AD治疗提供了一种新的治疗机制。这项研究为天然产物在AD治疗中的应用提供了新的理论支持，并为开发针对RIPK1的神经退行性疾病治疗策略奠定了基础。

章节摘录

Sar特异性结合RIPK1并增强其结构稳定性

为了检测Sar（图1A）与RIPK1之间的结合能力，我们使用BLI定量测量了体外Sar与RIPK1的结合亲和力。该技术具有高灵敏度、良好的重复性，且无需标记，是评估小分子-蛋白质结合强度的金标准之一。在我们的实验中，纯化的重组人RIPK1激酶结构域蛋白被固定在生物传感器表面，然后与不同的

讨论

本研究提供了令人信服的机制证据，表明Sar通过调节两条途径之间的相互作用来靶向RIPK1信号通路，直接抑制坏死性凋亡并间接调节焦亡，从而在AD中发挥双重神经保护作用。据我们所知，这是首次系统验证Sar作为天然RIPK1抑制剂的作用，证明了其作为AD治疗剂的潜力。这些发现为AD的治疗提供了新的策略。

化学物质和抗体

Sar由中国成都Push生物技术有限公司提供（纯度>98%，#PS020485）；Nec-1由中国上海Taoshu生物技术有限公司提供（#T1847）；Aβ_25–35由中国杭州Chinesepeptide有限公司提供（#AMYD-051）。本研究中使用的抗体来源如下：抗RIPK1（#3493，Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞州丹弗斯），抗pRIPK1（#TA7377F，Abmart，中国上海），抗RIPK3（#ER1901–27，Huabio，中国杭州），抗pRIPK3（#HA721428，Huabio，中国杭州）

CRediT作者贡献声明

郭玉杰：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，方法学，研究，数据分析，概念化。李晓鹏：验证，方法学，研究，数据分析。陈月：验证，方法学，数据分析。李玉婷：方法学，数据分析。程青梅：方法学。江永国：验证。田世教：可视化。袁炳焕：方法学。刘艳：监督，资源获取，资金筹集。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本手稿中报告的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（82404605、U23A20510、U24A20806）、国家创新人才博士后计划（BX20220048）和中国博士后科学基金（2022MD723713）的支持。