组织 patterning（组织模式形成）是组织发育和再生的基础（Ramos等人，2024年）。我们一直使用鸟类胚胎皮肤外植体作为模型系统来研究皮肤及其附属结构的发育和形态发生过程。该模型的优势在于能够形成独特的羽毛芽几何排列，在明确的发育阶段每个羽毛芽的形状都易于观察（Jiang Ting-Xin等人，2004年；Chuong Cheng-Ming等人，2025年），并且便于进行测量和操作（Jiang Tingxin等人，2023年）。在发育中的鸡背部皮肤中，上皮-间充质相互作用导致从Hamburger & Hamilton阶段31（HH31）开始在形态发生场中形成周期性的羽毛原基（Hamburger和Hamilton，1951年），这些原基从中线开始向两侧扩展（Turing，1952年；Ho等人，2019年；Inaba等人，2019年；Curantz等人，2022年；Dhouailly，2024年；Chuong Cheng-Ming等人，2025年）。每个羽毛原基由一个上皮斑块和其下的真皮凝结层组成，逐渐形成（Inaba等人，2019年；Riddell和Headon，2025年）。芽中的真皮细胞通过缝隙连接形成功能性合胞体。短的羽毛芽会伸长为长的芽，建立起前后轴和近端-远端轴（Yu M等人，2002年；Li等人，2017年）。虽然我们之前的研究表明钙活性与细胞集体运动有关，但生物电流环路的形成机制以及具体参与的通道尚未得到探究。
除了生化信号传导外，越来越多的证据表明发育模式还受到离子通道、泵和缝隙连接产生的生物电信号的调控（Robinson和Messerli，1996年；Bates，2015年；Levin等人，2017年；Levin，2021年；Zhang和Levin，2025年）。发育中的生物电指的是在非神经组织中产生的空间模式化的跨上皮电场、离子流动和静息膜电位，这些信号在形态发生过程中起到指导作用。这些生物电信号在多个长度尺度上起作用，将局部细胞行为与长距离的组织级协调整合起来，并参与了多种发育过程，包括轴的形成、器官大小的控制和附属结构的形态发生。关键的实验和理论工作已经证明，特定的离子通道和转运蛋白通过调节膜电位模式和电流流动在塑造形态发生结果中起着关键作用（Perathoner等人，2014年；Lanni等人，2019年；Daane等人，2021年；Chen D等人，2025年；Mukherjee等人，2025年）。
下一个问题是离子通道活性如何与参与形态发生的形态发生因子相互作用。小鼠胚胎腭部间充质细胞的去极化会诱导钙依赖性的Bmp4释放，而在KCNJ2敲除小鼠中干扰钾通道活性会导致钙瞬变减少和BMP分泌减少，从而引发腭裂（Follmer等人，2024年）。与KCNJ2相关的人类多毛症进一步突显了这种联系：超极化的真皮成纤维细胞通过Wnt信号促进毛发生长，而去极化则会抑制这一过程；Kcnj2诱导的超极化可以逆转雄激素性脱发（Chen D等人，2025年）。在鸟类羽毛发育过程中，羽毛芽间充质中的同步钙活性与Shh分泌和缝隙连接相结合，指导远端细胞的运动（Li等人，2018年）。然而，钾通道和钙通道在羽毛形态发生中的相互作用尚未得到研究。
在本研究中，我们探讨了钾通道在皮肤形态发生中的作用，重点关注两个关键阶段：背部皮肤芽群的早期周期性模式形成和随后单个羽毛芽的形态塑造。通过Turing反应-扩散机制进行的生化信号传导利用了如Shh、Wnt、Bmp和FGF等分泌的形态发生因子。这些形态发生因子触发时空基因调控模式，导致二维羽毛原基阵列的形成（Turing，1952年；Jung等人，1998年；Lin等人，2009年；Desmarquet-Trin Dinh和Manceau，2025年；Riddell和Headon，2025年）。最初的对称羽毛芽随后沿着伸长方向演变成不对称结构（Chen C. W.等人，1997年；Li等人，2017年），这一过程受到芽上皮与极化活性间充质区之间相互作用的影响，涉及Wnt、Notch和非肌肉肌球蛋白等通路（Li等人，2013年）。
Turing反应-扩散机制涉及形态发生因子在短距离内的缓慢扩散，可能与通过离子通道进行的高速长距离电信号传导相互作用，从而影响组织发育（Lanni等人，2019年；Daane等人，2021年；Zhang和Levin，2025年）。例如，在HH26阶段使用siRNA或显性负形式抑制缝隙连接通道connexin 30可以阻止真皮凝结层的形成（Tseng等人，2024年），而在HH34阶段阻断缝隙连接则会引发新的羽毛芽波形出现，这表明抑制剂在这个阶段可以通过缝隙连接长距离传递（Tseng等人，2024年）。此外，在鸡皮肤上施加稳定或脉冲电流会破坏羽毛芽的方向，表明内源性生物电活动参与了这一过程（Jiang Ting-Xin等人，2021年）。基因编码的钙指示剂GCaMP6显示，在HH31阶段短羽毛芽中存在振荡的钙活性，这种活性以Shh/Wnt/缝隙连接依赖的方式从伸长的HH 32-36羽毛芽的尖端传播为行波。抑制特定的电压门控钙通道（iCRAC，钙释放激活的钙通道）或缝隙连接通道会导致钙信号减弱，从而阻碍羽毛发育（Li等人，2018年）。
我们应用了Lionel Jaffe和Richard Nuccitelli最初开发的振动探针技术（Jaffe和Nuccitelli，1974年），在三维空间中测量和绘制发育中羽毛芽的细胞外离子电流（Li等人，2018年）。如图所示，在HH31阶段，背部皮肤表面的所有电流都向内流动（图1A，右侧面板）。然而，到了HH35阶段，随着羽毛芽的形成和伸长，从前部芽区域开始出现外向电流，而芽尖处仍然保持内向电流，形成一个连续的或持续的电流环路：电流进入芽尖，通过缝隙连接的间充质传递，从芽基部流出，然后通过细胞外液返回芽尖。钙通道阻断剂证实了钙通道参与内向生物电流的形成（Li等人，2018年），但由于这些通道不传导外向电流，我们推测钾通道介导了外向电流以完成整个环路。事实上，我们之前的批量RNA测序分析（图1B）识别出一组钾通道及相关蛋白质，这些蛋白质可能调节羽毛芽间充质细胞中的钾通道功能（Li等人，2018年）。原位RNA杂交实验确认了它们位于前部羽毛芽基部（Li等人，2018年）。
特别值得关注的是KCTD蛋白的表达，这些蛋白可以调节Gβγ蛋白的功能，进而影响内向整流钾通道和双孔钾通道的功能（Leaney等人，2001年；Feliciangeli等人，2015年），这些都是膜静息电位的关键决定因素。内向整流钾通道和双孔钾通道不是电压门控的，它们可能介导持续的环路电流。
羽毛芽间充质细胞形成了一个通过缝隙连接耦合的细胞集体，使得荧光染料lucifer yellow能够在细胞间传递，从而在HH35阶段验证了它们的连通性（Li等人，2018年；Tseng等人，2024年）。因此，环路电流可能从羽毛芽尖端进入细胞，通过缝隙连接的细胞沿芽轴传递，从前部基部流出，然后通过细胞外介质返回尖端。
本研究探讨了钾通道在羽毛芽中建立持续电流环路的功能。电流环路需要位于不同位置的多种通道类型来维持电流的流动。阻断钾通道应该会阻断或改变正常电流的方向。我们还评估了破坏这一电流环路是否会影响羽毛芽的周期性模式、伸长以及分子标记物的表达。
