《Environmental Pollution》：Atrazine increases hepatic inflammation and injury via endoplasmic reticulum (ER) stress mediated excessive formation of mitochondria-associated membranes (MAMs) and activation of the cGAS-STING pathway
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阿特拉津通过内质网应激诱导线粒体相关膜异常聚集，导致线粒体钙超载、活性氧增加和mtDNA释放，激活cGAS-STING通路及NLRP3炎症小体，引发肝炎症损伤，并验证了4-PBA和MitoQ的有效干预。
孙子军|单冠月|万慧|张玉欣|高志成|史文娜|吕磊|严伟群|李海军
中国吉林省长春市吉林大学第一医院肿瘤免疫学实验室，130021
摘要
尽管阿特拉津（ATR）作为一种三嗪类除草剂被广泛使用，但它对健康构成了严重威胁，其引发肝脏炎症的机制尚未完全阐明。我们的研究揭示了一个机制级联反应：ATR暴露与内质网（ER）应激相关，进而刺激与线粒体相关的膜（MAMs）的过度生成。这一过程伴随着线粒体钙离子的过量积累、线粒体活性氧（mtROS）的产生增加以及线粒体DNA（mtDNA）向细胞质的转移。随后，细胞质中的mtDNA可能作为损伤相关分子模式（DAMP）发挥作用，激活cGAS-STING通路并促进NLRP3炎性小体的组装，最终引发严重的肝脏炎症反应。这些发现通过体外实验和小鼠模型得到了验证。此外，使用4-PBA抑制ER应激显著减少了MAMs的过度组装并改善了线粒体功能障碍。使用MitoQ清除线粒体ROS也有效减轻了下游的炎症反应。总体而言，本研究揭示了ATR诱导的肝毒性的新机制途径：ER应激-MAMs-线粒体损伤-mtDNA释放-cGAS-STING-NLRP3炎症，为环境化学物质的毒理学提供了新的见解，并为污染物引起的肝损伤提出了潜在的治疗策略。
引言
作为一种在全球农业中广泛使用的三嗪类除草剂，阿特拉津（ATR）因其化学稳定性而在环境中具有长期持久性，能够在土壤和水环境中长期存在，通常持续数周到数月[1]。这种持久性使其通过地表径流和渗漏进入多个环境介质，包括土壤、水和空气[2], [3]。欧盟自2004年起根据预防性规定禁止使用ATR；然而，在美国和中国等主要农业地区，ATR仍在有限范围内使用[4], [5]。人类主要通过饮食摄入和受污染的水接触ATR，使得慢性低水平ATR暴露成为环境毒理学中的一个日益严重的问题[6]。作为一种内分泌干扰物，ATR具有多种毒性作用[7]。研究表明，ATR可以干扰神经递质代谢，这与神经退行性疾病的风险有关[8]。它还可以抑制免疫细胞功能并降低身体的防御能力[9]。此外，ATR会损害线粒体功能并引发代谢紊乱[10], [11]。近年来的研究表明，ATR主要通过干扰细胞间信号传导发挥其毒性作用[12]。值得注意的是，ATR的毒性效应与其引发的线粒体功能障碍密切相关。然而，其具体的分子机制，特别是其在激活先天免疫/炎症通路中的潜在作用仍不清楚。
与线粒体相关的内质网膜（MAMs）是促进内质网和线粒体之间物理和功能连接的特化亚细胞结构，在调节钙稳态和生物能量代谢中起着关键作用[13]。这一钙交换过程的核心是嵌入MAMs中的IP3R-GRP75-VDAC1蛋白复合体，它调控钙离子从内质网腔向线粒体基质的定向流动，这对线粒体代谢活动的调节至关重要[14], [15], [16], [17]。MAMs的功能障碍会破坏钙离子运输，导致线粒体钙超载，从而触发一系列下游病理事件：最初会损害电子传递链的活性，增加活性氧（ROS）的生成；随后，钙水平升高会促进线粒体通透性转位孔（mPTP）的开放，导致线粒体膜电位的下降；最终，这些变化会促使线粒体DNA（mtDNA）释放到细胞质中[18], [19], [20]
cGAS在mtDNA泄漏到细胞质后能够识别它，并随后激活STING介导的信号通路。与mtDNA相互作用时，cGAS促进 secondary messenger 2′3′-cGAMP 的合成。这种分子通过诱导构象变化，使STING被招募到线粒体膜上。通过TBK1和IKK激酶的组装，STING驱动转录调节因子IRF3和NF-κB的磷酸化。磷酸化后的这些因子迁移到细胞核，刺激I型干扰素以及促炎细胞因子（包括TNF-α、IL-6和IL-1β）的转录，从而引发炎症反应[20], [21]。先前的研究表明，氧化的线粒体DNA片段通过mPTP和VDAC调控的通道从线粒体中释放出来。这种释放随后激活cGAS，进而促进NLRP3炎性小体和干扰素信号通路的激活[22]。基于现有证据，本研究旨在探讨ATR是否通过破坏MAMs来引发线粒体损伤和mtDNA泄漏，从而激活cGAS-STING通路，导致炎症和肝损伤的发生。
试剂和抗体
以下化合物购自MedChemExpress（上海，中国）：阿特拉津（ATR，货号1912-24-9）、4-苯基丁酸（4-PBA，货号1821-12-1）、MitoQuinone甲磺酸盐（MitoQ，货号845959-50-4）和RU.521（货号2262452-06-0）。针对ASC的一抗（货号CPA7120，WB稀释度1:500）、cGAS（货号CQA2570，WB稀释度1:1000）、CHOP（货号CBP1335，WB稀释度1:1000，IHC稀释度1:200）、p-STING（货号CPA6619，WB稀释度1:1000）、PGC1α（货号CQA5542，WB稀释度1:1000）和SIRT1（货号CQA2234，WB稀释度1:1000）
阿特拉津诱导的ER应激增加了内质网和线粒体之间的接触面积，并引发了线粒体钙超载
在探讨阿特拉津（ATR）对细胞的影响之前，我们首先评估了ATR在HepG2和L02细胞中的细胞毒性（图S1a），结果显示当ATR浓度低于800 μM时，两种细胞的存活率均保持在75%以上，表明在该浓度范围内ATR没有表现出显著的细胞毒性。因此，为了模拟ATR暴露对细胞系统的剂量依赖性生物学效应，我们设置了三个浓度梯度（200 μM、400 μM和800 μM）
讨论
根据联合国粮食及农业组织（FAO）的报告，过去三十年全球农药消耗量稳步上升，到2021年已超过400万吨，其中除草剂占总农用化学品消耗量的大约50%[30]。世界卫生组织（WHO）和联合国环境规划署（UNEP）指出，持久性有机污染物（POPs）和一些农用化学品对人类健康构成了长期威胁
结论
总之，本研究表明，阿特拉津暴露通过一系列协调的机制导致肝脏炎症损伤，包括内质网应激、与线粒体相关的膜过度形成、线粒体功能障碍以及随后的先天免疫信号通路激活。ATR诱导的ER应激增强了ER与线粒体的耦合，导致线粒体钙超载、线粒体膜电位下降和线粒体ROS增加
CRediT作者贡献声明
李海军：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金申请。严伟群：撰写 – 审稿与编辑。吕磊：软件操作、方法学研究。史文娜：实验研究、数据管理。孙子军：初稿撰写、软件操作、方法学设计、概念构建。高志成：软件操作、方法学研究。张玉欣：软件操作、方法学研究。万慧：软件操作、方法学研究、数据分析。单冠月：实验研究、数据管理
资助
本研究得到了吉林省自然科学基金（编号YDZJ202401218ZYTS）的支持。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了吉林省自然科学基金（编号YDZJ202401218ZYTS）的支持。感谢这些基金的支持。
