《Environmental Pollution》：High-molecular-weight species dominate the leaf soluble mercury pool: Rubisco as the primary binding protein
编辑推荐：
本研究通过SEC-ICP-MS等方法，发现植物叶片可溶性汞主要以高分子量形式存在，并与Rubisco酶结合，限制其转运并可能影响光合作用。
郝慧|范宇涵|刘彦伟|郭英英|侯星旺|刘继燕|尹永光|蔡勇|蒋贵斌
中国科学院生态环境科学研究中心环境纳米技术与健康效应实验室，北京 100085，中国
摘要
大气中元素汞（Hg(0)）的叶片吸收对汞的沉积和陆地循环有显著影响，但控制其迁移性、毒性和衰老后命运的具体汞物种仍知之甚少。本研究使用在受控条件下暴露于汞的杨树（Populus × euramericana）以及来自汞矿区的野生Erigeron annuus，调查了叶片中可操作溶解部分的汞物种，这部分汞具有迁移和转化潜力。尺寸排阻色谱（SEC）结合电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）显示，可溶性汞主要以高分子量形式存在于叶片总可溶性部分、甲酸提取物和叶绿体基质中，其洗脱峰接近过氧化氢酶（分子量：240 kDa）。超滤实验也证实，97.5%的可溶性汞位于>100 kDa的分子量范围内（540 ± 186 ng/g叶片鲜重）。通过蛋白酶K消化和SEC-ICP-MS分析进一步确定，结合蛋白质的汞是重要的形式。通过凝胶电泳分离和质谱分析，发现核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）是主要的汞结合蛋白，这可能是由于汞与蛋白质巯基的强结合。这些发现表明，高分子量汞物种而非低分子量汞复合物是可溶性汞的主要组成部分。Rubisco在叶绿体中的定位限制了汞在植物体内的迁移。此外，作为关键的光合酶，Rubisco与汞的结合为大气汞吸收与潜在的光合损伤之间提供了分子联系，需要进一步研究汞-蛋白质相互作用及其生理后果。
引言
高毒性的汞（Hg）主要以元素形式（Hg(0)）排放，这也是大气中汞的主要存在形式。植被对Hg(0)的吸收是大气汞沉积的重要组成部分（Jiskra等人，2018；Obrist等人，2017），并对陆地汞循环有显著贡献（Lu等人，2021；Wang等人，2019；Zhang等人，2025）。作为陆地生态系统中的主要大气汞汇，森林每年积累2200–3400 Mg的大气汞（Wang等人，2022）。大量的汞储存在叶片中，直到落叶后被雨水冲刷掉，转移到其他组织（如树干、根部）或在光还原后重新释放到大气中（Liu等人，2021；Liu等人，2021；Yuan等人，2019），对全球和区域汞循环产生重大影响。值得注意的是，叶片中的汞形态决定了其在植物体内的毒性、迁移和转化以及落叶后的环境影响。然而，叶片吸收Hg(0)后汞的化学形态仍知之甚少。
在大气汞积累在叶片中时，主要位于塔玛拉克树、美国榆树、糖枫和银杏的叶片内部（90.0–95.9%）（Laacouri等人，2013）。叶片吸收后，大量大气汞与细胞壁等固相结构稳定结合（Gustin等人，2022；Sun等人，2021）。与这种固定部分相比，一部分汞存在于可溶性部分，来源于细胞质和细胞器（如液泡、叶绿体）。虽然这部分汞仅占叶片总汞的一小部分（白杨叶：<15%；Tillandsia Usneoides：25.4–31.1%）（Gustin等人，2022；Sun等人，2025），但它可能包含多种汞形态，从小复合物和纳米颗粒到大分子结合的物种（Carrasco-Gil等人，2013；Chen等人，2009；Manceau等人，2018）。由于其不稳定性，这部分汞预计会在植物体内迁移。然而，一个有据可查但机制尚未明确的现象是汞从叶片向其他组织的迁移率较低（Assad等人，2016；Yuan等人，2022）。这表明汞的迁移可能受到其在叶片内化学形态的限制。因此，确定可溶性部分中的主要汞形态对于理解汞的生理和生态行为至关重要。
尽管叶片中可溶性汞的重要性显而易见，但其确切的化学形态仍不清楚。X射线吸收光谱（XAS）和质谱技术对于表征植物中的汞物种至关重要。XAS提供了有价值的大量相形态信息，并揭示了植物组织中HgS纳米颗粒和Hg-巯基复合物的共存（Carrasco-Gil等人，2011；Manceau等人，2015，2018）。在之前的研究中，对野生Marrubium vulgare叶片的扩展X射线吸收精细结构分析显示，HgS（58–83%）和结合生物巯基/蛋白质的汞（17–42%）是主要形式（Carrasco-Gil等人，2013）。然而，XAS缺乏区分固相结构中的汞与可溶性部分中汞的空间分辨率（Carrasco-Gil等人，2011；Manceau等人，2015，2018）。另一方面，液相色谱结合质谱（LC-MS）对已知的低分子量（LMW）汞复合物具有极高的灵敏度，成功识别了与植物螯合素（PCs）和谷胱甘肽（GSH）结合的汞复合物（Chen等人，2009；Gómez-Jacinto等人，2015；Iglesia-Turi?o等人，2006；Sobrino-Plata等人，2014）。然而，这些研究中常用的反相柱（如C18柱）是为小分子设计的，因此可能会忽略高分子量（HMW）汞物种，而这些物种可能占可溶性汞的很大比例。这一点很关键，因为HMW和LMW汞物种具有不同的生物学命运。LMW汞-巯基复合物（如与GSH或PCs结合的）是可移动的，并与解毒过程相关（Baycu，2002；Chen等人，2009），而HMW汞-蛋白质复合物可能移动性较差，可能会影响酶功能（Ajsuvakova等人，2020）。
为了克服这些限制，我们采用了尺寸排阻色谱（SEC）结合ICP-MS，该方法可以同时检测宽分子量范围内的可溶性汞物种（Küpper等人，2024；Latorre等人，2019；Tang等人，2024）。本研究的主要目的是表征叶片在吸收大气Hg(0)后可溶性部分中的汞物种，以更好地阐明其转化、迁移和相关生物风险。为此，我们系统地分析了暴露于汞的杨树叶片和野外采集的叶片，使用不同的提取方法结合SEC-ICP-MS进行分析。此外，还采用了超滤、蛋白酶K消化、SDS-PAGE和质谱进行蛋白质鉴定，以确定主要的汞结合生物分子。这些综合分析为叶片汞的形态和风险提供了重要的机制见解。
化学物质和试剂
用于制备不同分子量汞复合物的试剂包括：Hg(II)储备溶液（1000 μg/mL，溶于5% HNO3）、来自牛肝的过氧化氢酶（CAT，Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO）、人血清白蛋白（HSA，Xiya Chemical Technology，临沂，中国）、金属硫蛋白（MT，Ruiyong Biotechnology，上海，中国）、(γGlu-Cys)4-Gly（PC4，Kangbei Biochemical，宁波，中国）和谷胱甘肽（GSH，J&K Scientific，北京，中国）。用于蛋白质消化的蛋白酶K来自Tritirachium album和大豆
不同分子量汞-生物分子复合物的SEC-ICP-MS分析
为了使用SEC-ICP-MS识别叶片中的可溶性汞物种，我们首先使用不同的生物分子建立了汞的洗脱谱。作为比较，选择了CAT（240 kDa）、HSA（66 kDa）、MT（6 kDa）、PC4（1 kDa）和GSH（307 Da）来形成不同分子量的汞复合物。它们的SEC-ICP-MS洗脱时间顺序为：Hg-CAT（131 s，157 s；范围：115–200 s）< Hg-HSA（166 s；范围：140–210 s）< Hg-MT（189 s；范围：155–240 s）< Hg-PC4（186 s；范围：165–230 s）< Hg-GSH（207 s；
结论
本研究表明，无论是来自暴露于汞的杨树还是野生Erigeron annuus的叶片中的可溶性汞，主要以高分子量形式存在，其中Rubisco被确定为主要的汞结合蛋白。这些发现表明，高分子量汞物种而非低分子量汞复合物是可溶性汞的主要组成部分，这一成分之前被忽视了。汞与结构受限的Rubisco的结合可能限制了其在植物体内的迁移并延长了其停留时间
作者贡献声明
蒋贵斌：项目监督、管理。范宇涵：数据可视化、实验研究。郝慧：初稿撰写、实验研究、数据分析。郭英英：方法学设计、实验研究。刘彦伟：撰写、审稿与编辑、数据可视化、验证、实验研究、资金争取、概念构思。刘继燕：资源协调、概念构思。侯星旺：撰写、审稿与编辑、资金争取。蔡勇：方法学设计、概念构思。尹永光：撰写——
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（42394093、22425606、22376209和22576222）的支持。
