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G3BP1抑制 rainbow trout 对 IHNV 的抗病毒作用及应激颗粒机制研究。
Jing-Zhuang Zhao|Yi-Zhi Shao|Wei-Tong Liu|Tong-Yan Lu|Li-Ming Xu
中国水产科学院黑龙江渔业研究所，哈尔滨 150070，中华人民共和国
摘要
Ras-GTP酶激活蛋白（SH3结构域）结合蛋白1（G3BP1）是一种RNA结合蛋白，参与哺乳动物细胞的应激反应和抗病毒免疫，在应激颗粒（SG）的组装中起核心作用。然而，其在低等脊椎动物中的功能仍知之甚少。在本研究中，我们从虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）中克隆并表征了G3BP1，将其命名为OmG3BP1，并探讨了其在感染性造血坏死病毒（IHNV）感染中的作用。OmG3BP1的开放阅读框编码了一个由489个氨基酸组成的蛋白质，预测分子量为54.06 kDa。OmG3BP1包含五个保守的功能结构域，并在系统发育上与其他鱼类同源物聚类。OmG3BP1在所有检测的组织中均表达，其中肌肉、肝脏和心脏中的表达水平最高。体外实验表明，过表达OmG3BP1显著抑制了IHNV的复制，并伴随着干扰素相关基因表达的增加。通过siRNA敲低OmG3BP1显著增强了病毒复制，进一步证实了其抗病毒作用。此外，我们发现IHNV感染通过磷酸化真核翻译起始因子2α（eIF2α）诱导RTG-2细胞中应激颗粒的形成。我们的研究结果表明OmG3BP1对IHNV具有抗病毒活性，并为IHNV的发病机制和抗病毒药物研究提供了新的见解。
引言
在面对环境压力（如紫外线照射、内质网应激、热休克和病毒感染）时，细胞会迅速抑制翻译，导致多聚核糖体解体[1]。从解体的多聚核糖体中释放出的未翻译mRNA面临两种命运：沉默或降解[2]。为了处理这些mRNA，细胞会组装各种类型的RNA颗粒，如应激颗粒（SG）和加工P小体（PB），这些颗粒对mRNA的调控至关重要[3]。SG是由未翻译mRNA、翻译起始因子亚基、40S核糖体亚基以及RNA结合蛋白（如poly(A)结合蛋白）组成的动态凝聚物[4]、[5]。SG的关键标记物包括Ras-GTP酶激活蛋白（SH3结构域）结合蛋白1（G3BP1）、T细胞限制性细胞内抗原1（TIA-1）和TIA-1相关蛋白（TIAR），它们各自含有自相互作用结构域[6]、[7]、[8]。G3BP1、TIA-1或TIAR的自寡聚化对于SG的组装至关重要，任何一种蛋白的过表达都能诱导SG的形成[9]。虽然有多种机制可以触发SG的组装，但最明确的机制涉及真核翻译起始因子2α（eIF2α）的磷酸化[10]。
G3BP1属于Ras-GTP酶激活蛋白（SH3结构域）结合蛋白家族，它在环境压力下调节基因表达[11]。作为一种多功能蛋白，G3BP1参与许多生物过程，包括RNA代谢、细胞增殖、分化和凋亡[11]、[12]、[13]。癌症研究显示，G3BP1在多种恶性肿瘤（如乳腺癌、肺癌和肾癌）中过度表达[14]、[15]、[16]，这表明靶向G3BP1可能开辟一种新的治疗策略[6]。最近的研究还表明G3BP1在抗病毒防御中发挥作用：它与病毒蛋白相互作用，并在严重急性呼吸综合征冠状病毒2型、寨卡病毒和西尼罗河病毒感染期间调节SG的组装[17]。此外，G3BP1可以结合来自病毒复制中间体的双链RNA（dsRNA），增强RIG-I介导的干扰素mRNA表达，从而促进干扰素刺激基因（ISGs）的翻译和抗病毒蛋白的表达[18]。相反，一些病毒（包括呼吸道合胞病毒[19]、丙型肝炎病毒[20]和基孔肯雅病毒[21]）利用G3BP1作为辅助因子来促进自身的复制。
尽管G3BP1在病毒感染哺乳动物中的作用已被充分研究，但其在鱼类病毒感染中的分子功能仍不甚清楚。迄今为止，仅有两项研究探讨了G3BP1与鱼类病毒之间的关系，报道了其在红点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV）和病毒性出血性败血症病毒（VHSV）感染中的不同生物学功能[22]、[23]。虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）是养殖最广泛的鱼类之一，对全球进出口经济贡献巨大。然而，由感染性造血坏死病毒（IHNV）引起的感染性造血坏死病（IHN）爆发会导致幼鱼死亡率高达90%，对虹鳟鱼养殖业构成严重威胁[24]。因此，了解病毒发病机制和病毒-宿主相互作用对于开发有效的控制策略至关重要。
据我们所知，此前没有研究探讨过G3BP1与IHNV之间的关系。为了阐明G3BP1在IHNV感染中的生物学功能，我们克隆了虹鳟鱼中的G3BP1完整序列（OmG3BP1），并研究了其在病毒感染过程中的作用。我们的发现加深了对G3BP1与IHNV感染关系的理解，为开发抗IHNV治疗药物提供了新的见解。
部分摘要
鱼类、病毒和细胞系
虹鳟鱼（平均体重10±1克）购自当地农场，该农场在过去五年内未报告过病毒爆发。使用先前报道的方法[25]进一步检测这些鱼，确认其不含IHNV或其他病毒。从流行病学调查中分离出IHNV菌株Sn1203（GenBank编号：KC660147.1）并储存在我们的实验室[26]。虹鳟鱼的生殖细胞（RTG-2，ATCC编号：CCL-55）也储存在我们的实验室中。RTG-2细胞系在MEM培养基中培养。
OmG3BP1的序列分析
OmG3BP1的完整开放阅读框（ORF）长度为1470个核苷酸，编码一个由489个氨基酸组成的蛋白质。OmG3BP1的预测蛋白质分子量为54.06 kDa，理论等电点为5.28。蛋白质同源性分析显示，OmG3BP1与其他鱼类物种的G3BP1具有77.39%至96.53%的序列一致性，与哺乳动物同源物的序列一致性为65.03%至66.46%（图1）。
讨论
Ras-GTP酶激活蛋白结合蛋白家族包含一系列RNA结合蛋白，其中包括G3BP1。先前的研究表明，G3BP1是蛋白质-RNA相互作用网络的核心组成部分，并参与多种生物过程，包括哺乳动物细胞中的抗病毒反应[6]。然而，G3BP1在低等脊椎动物（尤其是鱼类）中的功能及其与鱼类病毒的关系仍不清楚。因此，在本研究中，我们
结论
总之，我们从虹鳟鱼中克隆并表征了OmG3BP1，并证明了其对IHNV的抗病毒作用。IHNV感染时，OmG3BP1的表达以组织特异性的方式受到调控。OmG3BP1的过表达抑制了病毒复制，并伴随着干扰素相关基因表达的增加，而敲低则增强了病毒复制。此外，IHNV感染通过eIF2α的磷酸化诱导了SG的形成，表明OmG3BP1参与了这一过程。
伦理声明
本研究中的所有动物实验均遵循中国水产科学院黑龙江渔业研究所关于实验动物护理和使用的指南。动物实验得到了该研究所实验室动物福利与伦理委员会的审查和批准。
作者贡献声明
Jing-Zhuang Zhao：概念提出、研究设计、撰写-审稿和编辑、资金获取。Yi-Zhi Shao：软件开发和可视化。Wei-Tong Liu：实验设计、数据分析。Tong-Yan Lu：实验监督和项目管理。Li-Ming Xu：撰写-审稿和编辑、项目管理。
资助
本研究得到了国家自然科学基金 [32202988]、黑龙江省自然科学基金 [YQ2024C037]、中国水产科学院中央公益性科研机构基础研究基金 [2023TD45]以及黑龙江省重点研发计划 [JD24A013]的支持。
