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本研究从大型黄颡鱼中鉴定新型脂ocalin样蛋白LcApoM_AGPRP，证实其通过破坏细菌膜、抑制运动及干扰生物膜形成发挥广谱抗菌作用，且在25-100℃及0-40‰盐度下稳定性高，为水产应用提供新资源。
Ruyu Huang|Chunmei Yan|Yingge Lv|Yani Jin|Dongling Zhang
中国厦门集美大学农业部与农村事务部东海健康海水养殖重点实验室
摘要
脂质运载蛋白在脊椎动物的免疫防御中起着关键作用；然而，它们在硬骨鱼类中的功能机制仍知之甚少。本研究以经济价值较高的海洋鱼类大黄鲷（Larimichthys crocea）为模型，探讨了一种新型脂质运载蛋白样蛋白LcApoM_AGPRP，并阐明了其在免疫反应中的作用。在大黄鲷中鉴定出一种潜在的抗菌蛋白LcApoM_AGPRP，但其基因组中缺乏功能注释。LcApoM_AGPRP在健康大黄鲷的肝脏、头肾、卵巢、鳃和精巢中高度表达。在LPS和Poly(I:C)刺激后，其表达显著上调，表明其在先天免疫反应中可能发挥作用。亚细胞定位分析显示，LcApoM_AGPRP主要定位于溶酶体中，部分分布在高尔基体和线粒体中，还分布于内质网中，这暗示了其在细胞器介导的免疫防御中的作用。功能测定表明，LcApoM_AGPRP具有广谱抗菌活性。该重组蛋白通过多种机制发挥抗菌作用，包括破坏细菌膜完整性、抑制细菌运动能力和干扰生物膜形成。稳定性实验进一步证实，其在广泛的温度（25–100 °C）和盐度（0–40 ‰）范围内仍保持抗菌活性，显示出很强的环境适应性。这些特性表明LcApoM_AGPRP作为抗菌剂、水产饲料添加剂或食品防腐剂的潜力巨大。本研究首次系统地鉴定并表征了LcApoM_AGPRP的功能，为了解硬骨鱼类的先天免疫系统提供了新的见解。
引言
大黄鲷（Larimichthys crocea）是一种重要的海洋经济鱼类，也是集约化水产养殖的典型代表。然而，随着水产养殖规模的扩大、水环境的恶化以及种质资源的减少，疾病问题已成为制约大黄鲷产业发展的瓶颈[1], [2], [3], [4]。L. crocea中细菌感染较为常见，主要病原体包括Vibrio、Nocardia和Pseudomonas属细菌，给水产养殖业带来了巨大的经济损失[5], [6], [7], [8]。对于细菌性疾病，目前仍主要依赖抗生素进行预防和治疗，这导致了细菌耐药性的增加、水环境破坏以及食品安全问题[9]。抗菌肽（AMPs）具有广谱抗菌活性，且不易产生耐药性，目前被认为是抗生素的最佳替代品[10]。
在我们之前的研究中，通过Bacillus subtilis表达系统从大黄鲷中成功鉴定出一种新的抗菌肽Lc149[11]。序列分析显示，该蛋白的保守结构域与载脂蛋白M和α-酸性糖蛋白相匹配，属于一种新型脂质运载蛋白样蛋白。在此基础上，进一步研究了Lc149的全长，并将其命名为LcApoM_AGPRP（来自L. crocea的载脂蛋白M和α-酸性糖蛋白相关蛋白）。脂质运载蛋白家族是一类广泛存在于细菌、真菌、植物和动物中的小分子细胞外蛋白。脂质运载蛋白通常由160-180个氨基酸组成，分子量约为20 kDa，在一级结构上序列同源性较低[12], [13], [14]。它们具有高度保守的三级结构，其特征是由八个反平行链构成的β-桶状结构以及中央的环状疏水口袋。疏水口袋可以结合多种小分子疏水配体，包括类固醇、胆汁磷脂、维生素A和脂肪酸[15]。它们在调节免疫反应、细胞迁移、增殖和分化方面起着重要作用[16]。
载脂蛋白M（ApoM）主要存在于高密度脂蛋白（HDL）中，并在肝脏和肾脏中表达[17], [18]，其主要功能是参与脂质转运[15], [19]。研究表明，ApoM在抗菌、先天免疫和炎症反应中发挥关键作用[20], [21], [22]。在狼疮和多发性硬化等炎症和自身免疫性疾病中，ApoM-S1P轴能够缓解炎症并维持内皮完整性[23], [24]。此外，ApoM在动脉粥样硬化和败血症中表现出免疫保护作用，通过减少促炎细胞因子的释放来减轻炎症损伤[25], [26]。α-酸性糖蛋白（AGP）是一种持续表达的急性期蛋白[27]，其表达主要受糖皮质激素、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的调控[28]。它在败血症和自身免疫性疾病中通过抑制促炎细胞因子（如TNF-α和IL-6）的分泌来发挥免疫调节作用，从而增强宿主对感染的耐受性[27]。通过对三倍体鲫鱼中脂质运载蛋白2（3nLcn2）的研究，证实3nLcn2是一种具有抗菌活性的功能性脂质运载蛋白，在细菌感染期间在免疫防御中起重要作用[29]。当尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）感染Streptococcus agalactiae时，ApoM可通过增加抗炎细胞因子IL-10的表达并减少促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达来提供生存率[20]。这些发现突显了ApoM/AGP相关脂质运载蛋白的多方面免疫学作用，强调了它们作为炎症疾病、感染和免疫障碍治疗靶点的潜力。
在本研究中，我们从大黄鲷中鉴定出一种脂质运载蛋白样蛋白，并将其命名为LcApoM_AGPRP。首先检测了健康鱼类中LcApoM_AGPRP的组织分布，并分析了其在脂多糖（LPS）和聚肌苷酸（Poly(I:C)刺激下头肾和肾细胞中的表达模式。随后，通过构建含有细胞器特异性染色的真核表达载体，确定了LcApoM_AGPRP的亚细胞和细胞器定位。此外，还评估了重组LcApoM_AGPRP对Vibrio vulnificus、Vibrio alginolyticus和Staphylococcus aureus的抗菌活性，并研究了其潜在的抗菌机制。这项工作首次系统地鉴定并表征了LcApoM_AGPRP的功能，为其表达模式和广谱抗菌特性提供了宝贵见解，为探索新型抗菌蛋白作为潜在治疗剂奠定了基础。
伦理声明
所有实验鱼类在采样和解剖观察前均使用三卡因甲磺酸盐（MS-222；Sigma，St. Louis，MO，USA）进行麻醉，符合集美大学水产学院动物护理和使用委员会的批准指南。
细胞和细菌
大黄鲷头肾细胞由福建农林大学的陈新华教授提供，肾细胞购自上海千禧生物公司。
LcApoM_AGPRP的特性
开放阅读框（ORF）长度为636 bp，编码212个氨基酸的多肽（图1A），预测分子量为23.39 kDa，等电点（pI）为4.55。结构域分析显示存在N端信号肽和保守的ApoM/AGP相关脂质运载蛋白样结构域（图1B）。此外，三级结构预测表明LcApoM_AGPRP具有典型的脂质运载蛋白折叠结构，其特征是由八个反平行链构成的β-桶状核心结构以及中央的环状疏水口袋。
讨论
脂质运载蛋白是一类广泛分布于脊椎动物和无脊椎动物中的分泌蛋白，参与多种生理和免疫过程[34], [35], [36], [37], [38]。在水生生物中，脂质运载蛋白样分子逐渐被认为是先天免疫反应的关键介质[20], [29], [39]。然而，水生物种中脂质运载蛋白的功能表征仍然相对较少，这突显了我们研究的意义
结论
总之，本研究鉴定出LcApoM_AGPRP是一种具有广谱抗菌活性的潜在抗菌蛋白。结合表达和定位分析表明，它参与了大黄鲷的先天免疫防御反应，突显了其在宿主免疫中的潜在作用以及对未来研究硬骨鱼类中脂质运载蛋白样抗菌蛋白的重要性。
数据获取
数据可应要求提供。
资助
本工作得到了国家自然科学基金（编号32172964）、福建省促进海洋和渔业产业高质量发展专项基金（编号FJHYF-L-2025-17）以及厦门市科技局-产业大学研究补贴项目（2024CXY0320）的支持。利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
