《Food and Chemical Toxicology》：Molecular crosstalk between PPARγ and AhR determines the profile of the amiodarone (AMD) endocrine disruptor in hippocampal neurons
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胺碘酮在HT-22神经元模型中呈现浓度依赖性神经毒性，1 μM非毒性浓度通过调控AhR/PPARγ信号轴影响神经类固醇分泌，其中PPARγ拮抗剂GW9662与AMD协同抑制激素分泌，证实AhR-PPARγ交叉对话机制在AMD神经毒性和激素干扰中的关键作用。
Konrad A. Szychowski | Bartosz Skóra
生物技术与细胞生物学系，热舒夫信息技术与管理大学医学院，St. Sucharskiego 2号，35-225 热舒夫，波兰
摘要
胺碘酮（AMD）是一种强效的抗心律失常药物，尽管有报告指出它具有神经毒性和干扰内分泌系统的特性。本研究评估了AMD在海马神经元模型（分化的HT-22细胞）中的毒性及其对神经类固醇分泌的影响。AMD仅在高浓度（10–50 μM）下表现出神经毒性。在非毒性浓度（1 μM）下，AMD降低了CYP19A1、CYP17A1、CYP1A1、CYP1B1、PPARγ、AR和ER1的mRNA表达，同时增加了AhR、NF-κB、ER2和17β-HSD的表达。AMD还降低了AhR和PPARγ的蛋白水平，并改变了AhR/PPARγ调控的转录本，表明这两种信号通路都参与了这一过程。此外，AMD减少了雌二醇的分泌和芳香化酶的蛋白水平，但对孕酮或睾酮没有显著影响。与PPARγ拮抗剂GW9662联合使用可进一步降低这三种激素的分泌。使用AhR拮抗剂CAY10464和GW9662的实验表明，AMD通过PPARγ–AhR轴调节激素的产生。AhR阻断的抑制作用似乎被PPARγ的活性所补偿，而PPARγ的抑制则消除了这种保护作用，揭示了AhR介导的类固醇生成的更强调节作用。蛋白质分析进一步支持了涉及AhR–PPARγ相互作用的复杂机制。
引言
胺碘酮（AMD；CAS编号19774-82-4）是最强效的抗心律失常药物（Barra等人，2022年）。然而，其使用受到多种潜在毒性和不良反应的限制，如肺炎（Coudert等人，1992年）、肝毒性（Babatin等人，2008年）或恶心（Jafari-Fesharaki和Scheinman，1998年）。除了这些经典的不良反应外，还有几份病例报告描述了AMD引起的神经毒性和神经系统中的严重变化（Pathmanathan和Cleary，2021年；Willis和Lugo，2009年）。据报道，接受平均剂量200毫克/天的患者中约有2.8%会出现AMD引起的神经毒性（Orr和Ahlskog，2009年）。
根据剂量不同，AMD的血浆浓度范围为0.4至11.99 μg/mL（Latini等人，1984年），相当于0.58至17.58 μM。然而，常用的治疗剂量导致AMD的血浆浓度约为2 μM（Lafuente-Lafuente等人，2009年）。此外，研究表明，在1.25和1.5 μM的浓度下，AMD能够轻易穿过血脑屏障（BBB）并在体外模型中抑制胆碱乙酰转移酶（ChAT），这可以作为毒性的标志（Algharably等人，2021年）。体外研究表明，1.5 μM的AMD会抑制神经元分化，减少增殖，并损害星形胶质细胞的分化（Nunes等人，2023年）。AMD在多种细胞培养模型中的总体毒性已被描述，包括人原代内皮细胞、人肝细胞（HepG2）细胞系、人上皮细胞（EAhy 926）细胞系和猴肾（Vero）细胞系（Baudin等人，1996年；Golli-Bennour等人，2012年）。不幸的是，AMD的确切神经毒性机制仍很大程度上未知。尽管如此，人们普遍认为AMD毒性的主要机制之一是活性氧（ROS）的生成（Szychowski，2025年）。
迄今为止，已有报道指出AMD会在大鼠后代体内积累并容易穿过胎盘（Hill和Reasor，1991年）。人类中也观察到了同样的现象（Plomp等人，1992年）。重要的是，AMD也在人乳中被检测到。一些作者认为，产前接触AMD会影响胎儿的神经发育和神经发生（Plomp等人，1992年）。研究表明，AMD会干扰类固醇的生物合成（Korade等人，2022年）。因此，在怀孕期间使用AMD可能对后代的发育中的大脑产生不利影响（Plomp等人，1992年）。这些特性表明AMD可能具有干扰内分泌系统的化合物（EDC）的特性，但这一方面目前研究较少（Sabir等人，2019年）。
由外源物质和EDC引起的神经毒性通常涉及两个关键受体：芳基烃受体（AhR）和过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARγ）（Szychowski和Skóra，2024年）。AhR因其在环境因素引起的毒性中的作用而闻名（Stevens等人，2009年）。然而，AhR还调节基本的细胞和分子过程，如外源物质的代谢、免疫反应和癌症的发展（Kim，2024年）。许多EDC作为AhR的激动剂或拮抗剂起作用（Shanle和Xu，2011年）。此外，AhR通过与雌激素受体（ERs）的相互作用参与细胞分化（Gong等人，2016年）。反过来，PPARγ主要参与葡萄糖代谢、脂质储存、细胞死亡、增殖、分化和凋亡（Lau等人，2010年）。与AhR类似，PPARγ也参与外源物质的代谢和对有毒化合物的反应（Xi等人，2020年）。由于AhR和PPARγ与ERs的相互作用，它们也参与神经类固醇的生成和稳态，这对大脑功能至关重要（Juricek和Coumoul，2018年；Wójtowicz等人，2017年）。研究表明，类固醇激素如雌二醇（E2）、孕酮（P4）和睾酮（T）会影响AhR和PPARγ的表达和/或激活（Cao等人，2019年；Ma等人，1998年；Yang等人，2016年）。不幸的是，AMD对神经类固醇分泌的影响尚不清楚，而神经类固醇对大脑功能至关重要。
因此，本研究的目的是在体外海马神经元模型（分化的HT-22细胞）中评估AMD的神经毒性，并评估其对神经类固醇分泌的影响。此外，还确定了AhR和PPARγ受体作为外源物质和神经类固醇相关通路的代表，在mRNA和蛋白表达水平上的参与情况。
试剂
青霉素、链霉素、胺碘酮（A8423）、二苯基荧光素（DBF）、Immobilon-P、Western Blot相关试剂、二甲基亚砜（DMSO）和GW9662均从Sigma–Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买。不含酚红的DMEM培养基和磷酸盐缓冲盐水（PBS）从Corning（美国马纳萨斯）购买。通用RNA纯化试剂盒（E3598-02）、放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液、胎牛血清（FBS）和Fast Probe qPCR Master Mix（2x）（E0422-03）也均已购买。
分化HT-22海马神经元中的AMD毒性
24小时暴露后，10 μM和50 μM的AMD分别使LDH释放增加了86.01%和116.54%（图2A）。此外，根据LDH释放情况，计算得出50%致死剂量（LD50）为4.64 μM的AMD（表1）。在相同浓度（10 μM和50 μM）下，AMD分别使还原剂resazurin的还原减少了52.29%和65.11%（图2B）。根据还原剂resazurin的测定结果，计算出半数抑制浓度（IC50）。
讨论
我们的数据表明，10 μM和50 μM的AMD降低了还原剂resazurin的还原并增加了LDH的释放，证实了这些浓度在海马神经元中的显著细胞毒性。根据这两个参数，IC50和LD50的值分别约为9.20 μM和4.64 μM。基于这些观察结果，选择在本研究中使用的1 μM AMD浓度以反映生理和临床相关的暴露情况。
结论
我们的研究表明，AMD仅在最高测试浓度（10 μM和50 μM）下对从HT-22细胞系分化出的海马神经元表现出毒性。在非毒性浓度（1 μM）下，AMD降低了CYP19A1、CYP17A1、CYP1A1、CYP1B1、PPARγ、AR和ER1的mRNA表达，同时增加了AhR、NF-κB、ER2和17β-HSD的表达，并略微降低了CYP1A2的表达。此外，AMD降低了AhR和PPARγ的蛋白表达，并调节了下游基因的表达模式。
CRediT作者贡献声明
Bartosz Skóra：撰写——原始草稿、可视化、实验研究。Konrad Andrzej Szychowski：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、可视化、监督、资源提供、项目管理、资金获取、数据分析、概念化
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了波兰热舒夫信息技术与管理大学的法定资金支持（DS 503-07-01-27）。
