《Food and Bioproducts Processing》：Dual signal amplification-based lateral flow strip for rapid and sensitive detection of streptomycin in milk
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本研究开发了一种基于双信号放大的层流试纸法检测链霉素（STR），通过靶向突变优化aptamer使其结合常数降至6.87 nM，结合酶辅助循环和金纳米颗粒探针网络构建，检测限达17.6 nM，牛奶样品回收率95.8%-103.9%，为快速灵敏检测提供新方法。
张万琪|韩璐|尹彦豪| Mou尧婷|田宇航|孙志聪|吴彦芳|陈东飞|郭亚敏|孙霞|李法兰
山东工业大学农业工程与食品科学学院，中国山东省淄博市新村西路266号，255049
摘要
链霉素（STR）的过量残留对乳制品的质量和安全性构成重大风险。因此，开发高灵敏度的STR检测方法对于保障乳品安全和公共卫生至关重要。在本研究中，我们提出了一种基于酶辅助循环和复合探针（由多个金纳米粒子（AuNPs）组成的）的双信号放大侧向流动条（LFS）技术用于STR检测。通过定向突变，我们开发出一种名为Apt52-0的适配体，其对STR具有高亲和力，并能被Nt.Alwl切割内切酶识别，其结合常数（Kd）为6.87 nM，优于原始的Apt52。利用Apt52-0的发夹结构、Vent（exo-）DNA聚合酶和Nt.Alwl切割内切酶实现了酶辅助放大，从而使目标序列和双链DNA（dsDNA）能够进行双重循环。随后对循环产物进行等温扩增，并使用由多个AuNPs组成的复合探针构建了用于STR检测的双信号放大侧向色谱传感器。这种基于适配体的LFS技术的检测限（LOD）为25 nM，通过ImageJ软件分析得到的LOD为17.6 nM。在实际应用中，该试纸表现出良好的检测性能，在牛奶样本中的STR回收率达到了95.8%–103.9%。这种基于双信号放大的LFS方法提供了一种低成本、快速且灵敏的STR检测方式。
引言
链霉素（STR）是一种氨基糖苷类抗生素，具有稳定作用和广谱抗菌效果，对许多革兰氏阴性和部分革兰氏阳性细菌具有显著的抑制作用（Fan等人，2023；Waksman，1953）。它常用于治疗和预防奶牛的乳腺炎。尽管链霉素具有公认的治疗效果，但其滥用可能导致乳制品中残留，从而引发毒性、致畸性、致癌性以及抗生素抗性基因的传播等风险（Wang等人，2023a；Wang等人，2020）。原料奶中过量的抗生素残留还会干扰牛奶发酵过程，降低乳制品的产量和质量，给生产者带来经济损失（Adegbeye等人，2024；Tasci等人，2021）。因此，开发方便且精确的四环素类抗生素残留检测方法对于确保乳品安全和公共卫生具有重要意义（Wang等人，2022b）。
传统的STR微量检测方法包括色谱法及其联用技术、微生物检测法和免疫测定法（Dai等人，2017；Khaled等人，2019；Liu等人，2014）。尽管这些方法具有高灵敏度和特异性，但通常需要精密仪器和熟练的操作人员，导致检测过程缓慢且成本较高（Duan等人，2022）。这些限制阻碍了现场快速检测牛奶中STR残留的发展（Wang等人，2021）。近年来，电化学生物传感器（ECBs）由于检测速度快、灵敏度高以及无需大型仪器即可进行即时检测（POCT）的优势而得到快速发展。然而，它们仍面临操作复杂性、成本高和材料长期稳定性不足的问题，目前大多仍处于实验室研究阶段，无法满足复杂环境下的便携式和快速检测需求（Yadav等人，2021）。
侧向流动分析（LFAs）具有成本低、操作简单、无需专用设备或技术人员的优点（Jara等人，2022；Yu等人，2020）。由于其能在短时间内提供结果，非常适合用于POCT，便于大规模筛查和家庭自测。它已被广泛用于检测各种有害物质（Suo等人，2023）。在LFAs中，通常会加入多种材料以实现可视化或定量检测，可以通过肉眼观察或使用便携式检测设备（Nguyen等人，2020；Zhang等人，2024a）。目前，抗体常被用作LFAs中的识别元件，但它们存在稳定性有限、制备时间长和潜在免疫原性等问题（Tang等人，2024）。相比之下，适配体在稳定性、可控调节性和可重复使用性方面具有优势，使其成为开发基于适配体的侧向流动条（LFS）和扩展新型检测平台的有希望的选择（Dalirirad等人，2020；Li等人，2024）。使用适配体可以降低生产成本，通过目标结合和解离引起的构象变化实现重复使用，并与核酸扩增策略结合以提高检测灵敏度（Chen和Yang，2015；Dalirirad和Steckl，2019；Fang等人，2014）。
为了对低浓度目标分析物产生显著的信号响应，需要在检测策略中加入额外的信号放大策略。链置换扩增（SDA）是一种新型等温核酸扩增技术，具有简单、快速、高特异性和灵敏度等优点（Jiang等人，2023；Liu等人，2024；Liu等人，2022；Wu等人，2018）。该技术可以有效提高目标分子的利用率并增强检测信号（Xiao等人，2021）。核酸内切酶（NEases）仅在双链DNA（dsDNA）或DNA-RNA杂交体的单链上的特定识别序列处进行切割，具有高特异性。切割位点可以再生，并与DNA聚合酶协同作用，实现下一个切割和延伸循环（Jiang等人，2023；Mittal等人，2019）。通过连续的链置换、延伸和切割循环，单链DNA（ssDNA）能够实现指数级扩增（Abdallah等人，2025）。循环扩增产生的ssDNA产物可以作为后续循环中的信号放大激活剂或信号输出模块（Wang等人，2024）。
虽然荧光材料（如上转换纳米粒子和量子点）具有高灵敏度，但由于化学不稳定、需要大型设备进行信号读取以及复杂的表面修饰过程，其在LFS应用中受到限制（Chen和Park，2016；Huang等人，2020）。相比之下，金纳米粒子（AuNPs）无需特定激发光源即可发生颜色变化。由于其生物相容性、高摩尔吸收系数、易于标记和可见的颜色输出，它们被广泛用作LFAs中的信号标记物（Suo等人，2023；Wu等人，2021；Wu等人，2020）。然而，由于AuNPs的光学信号强度较低，使用LFS实现超灵敏检测具有挑战性（Zhou等人，2019）。试纸条（TL）中的信号强度取决于捕获的AuNPs数量。尽管有研究报道了通过金颗粒生长或聚合等方法提高检测灵敏度的策略，但在可控性、稳定性和简易性方面仍存在挑战（Li等人，2020；Pan等人，2018；Wang等人，2015）。
在本研究中，我们构建了一种基于双信号放大的LFS，用于现场快速检测STR。STR与其适配体的特异性结合会打开发夹结构，使Vent（exo-）DNA聚合酶能够延伸引物并释放目标分子，重新进入循环。Nt.Alwl切割内切酶切割双链产物后，Vent（exo-）DNA聚合酶在切割位点重新延伸引物，从而置换并积累目标序列。制备了两种AuNP探针以形成AuNP网络，增强目标序列的捕获并放大整体检测信号。STR浓度与TL处捕获的AuNPs数量直接相关。通过分析TL带灰度值与对照线（CL）的比值，建立了定量STR检测方法。这种基于适配体的LFS技术结合双信号放大策略，为牛奶样本中的STR检测提供了一种快速、灵敏且低成本的工具。
试剂和仪器
本实验中使用的所有STR适配体均基于我们实验室先前开发的Apt-52（Zhang等人，2024b）。定制合成的DNA序列从苏州鸿迅生物科技有限公司（中国苏州）获得，并通过高效液相色谱法纯化（表1）。Tris（2-羧乙基）膦（TCEP）从北京Solarbio科技有限公司（中国北京）购买。十二烷基硫酸钠（SDS）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）也用于实验。
具有双信号放大的侧向流动条（LFS）的构建
基于双循环和自我增强的侧向色谱测试条原理如图1所示。发夹结构包含STR特异性适配体Apt52-0和多胞嘧啶（polyC）块。在没有STR的情况下，发夹结构保持稳定，阻止引物杂交。然而，当存在STR时，它会与含有适配体序列的发夹结构结合，从而打开其茎环结构。
结论
在本研究中，通过对原始Apt52序列进行定向突变，我们开发出了Apt52-0适配体，提高了其对STR的亲和力（Kd = 6.87 nM），同时保留了酶识别的位点。利用Apt52-0作为识别元件，我们构建了一种用于快速现场STR检测的LFS，结合了酶辅助放大和基于多个AuNPs的双信号放大技术。STR的结合使Apt52-0的发夹结构打开，使其能够与引物杂交。
CRediT作者贡献声明
陈东飞：监督、资源提供。
吴彦芳：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源提供。
孙志聪：实验研究。
田宇航：软件开发、方法学设计。
韩璐：实验研究、数据管理。
张万琪：撰写 – 初稿撰写、验证、方法学设计、实验研究、数据管理、概念构思。
李法兰：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源协调、资金申请、概念构思。
孙霞：监督。
Mou尧婷：验证、数据管理。
郭亚敏：利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：32572675、3200178）、山东省自然科学基金（项目编号：ZR2025MS326、ZR2020QC249）、山东省高校青年教师创新团队发展计划（项目编号：2022KJ226）、中国博士后科学基金（项目编号：2023T160393、2022M721977）以及山东省科技中小企业创新能力提升项目（项目编号：2022TSGC1188）的支持。
