《Food and Bioproducts Processing》：Multiple pathway engineering combined with tolerance engineering promotes high-level acetoin biosynthesis in
Bacillus subtilis
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通过多水平代谢工程策略增强枯草芽孢杆菌的丙酮合成能力，包括增强磷酸转移酶系统和糖酵解关键基因表达、阻断丙酮酸外流、引入肺炎链球菌NADH氧化酶、融合ALS/ALDC酶、CRISPRi干扰竞争途径以及PHB途径增强细胞耐受性，最终在3L生物反应器中以87.9g/L产量实现工业潜力。
魏张|杨丽|李振东|李江华|杜国成|吕学勤|刘龙|吴耀康|黄子阳|刘彦峰
江南大学生物技术学院及教育部碳水化合物化学与生物技术重点实验室，中国无锡214122
摘要
乙酰丙酮是一种天然风味化合物，广泛存在于食品中，但其细胞毒性限制了微生物的产量。本研究在枯草芽孢杆菌中开发了一种多层次代谢工程策略来重建乙酰丙酮合成途径。增强了磷酸转移酶系统和糖酵解途径中关键基因的表达，并阻断了丙酮酸的过量生成，从而将碳流导向乙酰丙酮的前体。引入肺炎链球菌的NADH氧化酶后，摇瓶培养的OD600值从29.74提高到35.6。通过融合乙酰乳酸合酶（ALS）和乙酰乳酸脱羧酶（ALDC），提高了途径效率，使乙酰丙酮的浓度增加了11.5%，达到57.89克/升。进一步利用CRISPR干扰技术组合抑制了竞争途径中的六个目标基因，使浓度再次提高了26.2%，达到73.2克/升。引入聚羟基丁酸（PHB）合成途径后，增强了细胞的耐受性，使得在80克/升的乙酰丙酮浓度下仍能保持旺盛生长。最终，工程菌株在3升生物反应器中的乙酰丙酮浓度达到了87.9克/升，生产速率为1.45克/升·小时，产率为0.45克/克，为工业生产乙酰丙酮提供了有效的框架。
引言
乙酰丙酮（3-羟基-2-丁酮）是一种天然存在的化合物，存在于黄油和多种发酵食品中（Smit等人，2005年），具有独特的奶油香气。它被批准作为天然食品调味剂，常用于奶油、酸奶和水果基食品的配方中。除了食品行业外，由于其在制药、精细化工和化妆品领域的广泛应用，美国能源部将其列为优先平台化学品（Bozell & Petersen，2010年）。目前，工业生产乙酰丙酮主要依赖化学合成和生物催化工艺（Xiao & Lu，2014年）。然而，化学合成需要昂贵的催化剂和复杂的分离步骤（W. Meng等人，2022年），导致下游处理成本较高。虽然生物催化方法较为温和且环保，但依赖于昂贵的底物和外源性辅因子（Abuliti，2019年），从而限制了其规模化生产。因此，开发可持续且经济可行的高产量乙酰丙酮生产策略已成为迫切的技术需求（Petrov & Petrova，2021年）。
近年来，合成生物学和代谢工程的进步使得能够合理设计和系统优化微生物细胞工厂用于乙酰丙酮的生物合成（Cui等人，2022年）。与传统化学合成和生物催化相比，微生物发酵具有明显优势，可以利用廉价的可再生原料（如葡萄糖、淀粉和蔗糖），并在温和的环境条件下进行（Gavrilescu & Chisti，2005年；Hsu等人，2025年）。因此，微生物发酵已成为大规模生产乙酰丙酮的有前景且可持续的方法。已有多种微生物被用于此目的，包括枯草芽孢杆菌（Chen等人，2013年）、乳酸乳球菌（Xu等人，2025年）、谷氨酸棒状杆菌（Kou等人，2022年）、酿酒酵母（Bae等人，2021年）等（Diao等人，2023年）。其中，枯草芽孢杆菌因其强大的乙酰丙酮合成能力和天然代谢能力而特别具有吸引力（Deshmukh等人，2016年），使其成为迄今为止最广泛使用的工业生产菌株。
枯草芽孢杆菌因其非致病性、强大的分泌能力以及完善的遗传工具而被认为是绿色生物制造的优质微生物底盘。在枯草芽孢杆菌中，乙酰丙酮通过α-乙酰乳酸合酶（ALS）和α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）催化的两个连续酶促反应从丙酮酸合成。通过代谢工程，枯草芽孢杆菌的代谢网络被系统重组，构建了一个高效的乙酰丙酮生物合成细胞工厂。例如，张等人将NADH氧化酶引入枯草芽孢杆菌，以消除过量的细胞内NADH，从而抑制了2,3-丁二醇、乳酸和乙醇等NADH依赖性副产物的生成，使乙酰丙酮的产量增加了35.3%（Zhang等人，2014年）。随后，王等人优化了孢子形成和自溶相关基因，并使用相特异性启动子进一步增强了乙酰丙酮合成途径，在以甘蔗渣水解物为底物的5升生物反应器中达到了64.3克/升的浓度（理论产量的89.5%）（Wang等人，2022年）。在另一项研究中，Lidia等人使用甘油作为唯一碳源，并通过响应面方法优化了发酵参数，使乙酰丙酮浓度达到77.9克/升，生产速率为0.85克/升·小时（Tsigoriyna等人，2023年）。尽管取得了这些进展，当前的微生物生产系统仍面临主要挑战，包括前体供应不足（Hu等人，2024年）、碳流竞争激烈（Zhang等人，2025年）以及宿主菌株对乙酰丙酮的耐受性差（Yuan等人，2019年）（补充表2）。因此，进一步系统优化代谢网络和增强细胞耐受性对于实现工业可行的乙酰丙酮生产至关重要。
在本研究中，通过多层次代谢工程策略系统增强了枯草芽孢杆菌中的乙酰丙酮合成。首先，通过增强磷酸转移酶系统（PTS）和糖酵解模块中关键基因的表达并阻断丙酮酸的过量生成，增加了碳流向乙酰丙酮前体的流量。引入肺炎链球菌的NADH氧化酶后，改善了细胞内的氧化还原平衡，从而促进了摇瓶培养的生长。随后，融合了乙酰乳酸合酶（ALS）和乙酰乳酸脱羧酶（ALDC），使乙酰丙酮的浓度增加了11.5%，达到57.89克/升。在此基础上，利用CRISPR干扰技术组合抑制了竞争途径中的六个目标基因，使浓度进一步增加了26.2%，达到73.2克/升。引入聚羟基丁酸（PHB）合成途径后，增强了细胞的耐受性，使得在80克/升的乙酰丙酮浓度下仍能保持旺盛生长（图1）。最终，工程菌株在3升 fed-batch生物反应器中的乙酰丙酮浓度达到了87.9克/升，生产速率为1.45克/升·小时，产率为0.45克/克，展示了其出色的工业潜力。
化学试剂和材料
本研究中使用的所有化学试剂和质粒提取试剂均购自Sangon Biotech（中国上海）。乙酰丙酮标准品来自Yuanye Bio-Technology（中国上海）。T4 DNA连接酶和PrimeSTAR HS DNA聚合酶来自Takara Biomedical Technology（中国北京）。Hieff Canace? Gold HighFidelity DNA聚合酶（产品编号10148）来自Yeasen Biotechnology（上海）有限公司。无缝克隆试剂盒来自Beyotime Biotechnology
优化碳流和氧化还原平衡以促进乙酰丙酮合成
对于乙酰丙酮的合成，丙酮酸是直接且唯一的前体；因此，确保充足的丙酮酸供应对于高产量的乙酰丙酮生产至关重要（Soma等人，2022年；Yang等人，2025年）。为了增加细胞内的丙酮酸储量，首先增强了负责葡萄糖摄取的磷酸转移酶系统（PTS）。PTS系统利用磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）作为磷酸供体来导入葡萄糖，同时生成丙酮酸
结论
本研究在枯草芽孢杆菌中开发了一种多层次代谢工程策略，以重建乙酰丙酮合成途径并提高生产效率。通过合理分配碳流、精细调节细胞内氧化还原平衡和强化关键催化模块，显著增强了工程菌株的乙酰丙酮合成能力。ALS和ALDC之间的酶融合提高了途径的催化效率，而CRISPRi介导的动态抑制作用
CRediT作者贡献声明
魏张：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，数据可视化，概念化。杨丽：撰写 – 审稿与编辑。李振东：撰写 – 审稿与编辑。李江华：指导。杜国成：指导。吕学勤：指导，资金获取。刘龙：指导，资金获取。吴耀康：撰写 – 审稿与编辑，指导，资金获取。黄子阳：指导，资金获取。刘彦峰：撰写 – 审稿
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：鉴于吴耀康担任副编辑的职务，他未参与本稿的同行评审，也未接触到任何相关的评审信息。本稿的编辑过程完全由其他编辑负责。如果还有其他作者，他们声明没有已知的利益冲突或个人关系
致谢
本研究得到了国家重点研发计划食品营养与安全项目（2023YFF1104100）、国家自然科学基金（32300064、32570077）、江苏省合成生物学基础研究中心（BK20233003）和江苏省自然科学基金（BK20202002）的财政支持。
