一种用于验证经过超高热处理（UHT）处理的有机牛奶真实性的多技术化学计量策略：结合红外质谱（IRMS）、1H核磁共振（1H-NMR）和机器学习

《Food Control》：A Multi-Technique Chemometric Strategy for Authenticating Organic UHT-Treated Cow Milk: Combining IRMS, 1H-NMR, and Machine Learning

有机UHT牛奶认证研究采用IRMS和1H-NMR双平台化学计量策略，结合线性与非线性分类器，在法国校准集（171例）和测试集（172例）中分别达到97.1%/94.8%和98.8%/95.3%的准确率，融合决策规则使测试集准确率提升至96.5%。欧洲市场外部验证显示总体准确率83.3%，揭示δ1?N标记的局限性及有机-常规差异受饲养管理影响。研究提出多技术整合的标准化操作流程，为欧盟市场有机牛奶监管提供科学依据。

　　

克里斯托夫·B.Y. 科尔德拉（Christophe B.Y. Cordella）| 露西·ツァンバ（Lucie Tsamba）| 海伦·德贝滕库尔（Hélène Debetencourt）| 让-弗朗索瓦·莫兰（Jean-Fran?ois Morin）| 埃里克·贾明（Eric Jamin）| 罗多尔夫·维达尔（Rodolphe Vidal）| 索莱娜·茹尔德伦（Solene Jourdren）| 埃马纽埃尔·巴科尼埃（Emmanuelle Baconnier）| 莱斯·拉卡尔（Lyes Lakhal）| 多米尼克·贝特朗（Dominique Bertrand）| 弗雷迪·托马斯（Freddy Thomas）

LARTIC – 化学传感信息研究与处理实验室（Laboratoire de Recherche et de Traitement de l’Information Chimiosensorielle），拉瓦尔大学食品科学系（Département Sciences des Aliments），加拿大魁北克省魁北克市农业街2425号，邮编G1V 0A6

摘要

鉴于持续的欺诈风险和消费者的不信任，验证有机超高温灭菌（UHT）牛奶的真实性仍然是监管机构和行业的首要任务。我们评估了一种双平台化学计量策略，结合了稳定同位素比率质谱法（IRMS；δ¹³C、δ¹⁵N、δ¹⁸O、D/H）和¹H-NMR代谢谱分析，并使用线性和非线性分类器进行判断。模型开发和验证使用了来自法国的校准集（n = 171）和独立测试集（n = 172），同时通过一个欧洲的UHT牛奶样本集（n = 78）来评估方法的通用性。以无错误率（NER）表示，IRMS和NMR模型分别达到了97.1%/94.8%和98.8%/95.3%（校准/测试），而结合了TOFoo决策规则的模型将测试无错误率提高到了96.5%（平衡准确率为96.6%）。在欧洲样本集上，这种综合方法的整体无错误率为83.3%，各国之间的差异反映了市场的多样性。

除了性能之外，我们的结果还揭示了经典标志物在某些情况下可能失效的原因：δ¹⁵N通常被认为是区分有机产品的指标，但在我们的数据集中，有机牛奶和传统牛奶的δ¹⁵N范围有重叠，这可能与施肥方式、饲养制度和UHT加工过程有关。我们还观察到矩阵和加工过程对预期的“有机>传统”NMR模式产生了影响。通过系统地对比线性和非线性模型，并选择一种对有机类别高度敏感的简单、可审核的规则，我们实现了从概念验证研究向实际操作的多技术筛查工作流的转变。所有阶段的混淆矩阵和计数数据均已提供。这些结果支持在官方和私营部门控制中采用基于模型的双平台筛查方法来验证有机牛奶的真实性。

引言

牛奶营养丰富，含有大量的氮、蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质，是重要的饮食成分，尤其是对儿童而言。全球每年生产超过6.9亿吨牛奶，新西兰、欧盟（EU）和美国是主要出口国（经合组织数据）。2022年，欧盟的牛奶产量达到1.54亿吨，其中法国生产了2300万吨，主要集中在布列塔尼、诺曼底和卢瓦尔河地区。在法国，250万吨牛奶以瓶装液态形式销售，并经过超高温灭菌处理（CNIEL，2023年数据）。法国市场上半脱脂牛奶的消费和产量占主导地位（CNIEL，2023年；FranceAgriMer，2023年）。2021-2022年度，法国有机牛奶的产量占全国总量的5%以上，生产过程符合欧盟的有机法规要求。奶牛食用100%的有机、非转基因饲料，外部投入有限，其中至少60%为牧草，70%的牧草来自同一农场。根据条件，奶牛可以进入牧场，合成药物的年使用次数被限制在三次以内（欧盟委员会规定，2018年）。

消费者对有机牛奶的兴趣推动了2017年至2021年间产量的快速增长，2018年增幅达到32%。这一增长得益于消费者愿意为有机产品支付溢价（Hermansen，2003年）。然而，由于通货膨胀和消费者对有机标签的信任度下降，2022年增速放缓（Douarin，2024年）。

尽管有严格的监管和可追溯系统（欧盟委员会，2018年），欺诈行为仍然存在（Chung等人，2020年；Kang等人，2023年；Liu等人，2018年；Samarra等人，2021年）。欧盟委员会与欧洲刑警组织联合开展的OPSON VIII行动揭露了诸如未经授权使用物质和将传统产品错误标注为有机产品等非法行为（欧洲刑警组织，2019年）。这些问题损害了人们对有机农业的信任，并威胁到其可持续发展目标——欧盟计划在2030年前将有机土地使用比例提高到25%（“从农场到餐桌”战略）。

由于UHT牛奶成分受奶牛品种、泌乳期、饲料和地理位置的影响而存在较大变异性，因此验证其有机身份仍然具有挑战性。有机农业实践也存在差异。最常见的检测方法——农药残留分析——并不准确反映农业生产实际情况，因为许多传统产品不含农药，而一些有机产品可能因污染或允许使用的农药而含有残留物。因此，仅靠农药检测无法可靠地验证产品的有机状态。

需要采用替代的分析策略。稳定同位素比率，尤其是δ¹³C和δ¹⁵N，在有机和传统牛奶中存在差异，并且可以在牛奶中检测到（Giannioti等人，2024年）。传统牛奶中的δ¹³C值通常较高，因为饲料中玉米（一种C4植物）的比例较高，而有机农业系统在欧洲更依赖C3植物（Chung等人，2020年；Chung等人，2019年；Molkentin，2009年；Molkentin & Giesemann，2010年）。这些同位素标志物可以用于验证产品的有机身份。

在代谢组学研究中，已经发现有机牛奶和传统牛奶在脂肪酸和甘油三酯谱方面存在差异（Capuano等人，2015年；Mazzei & Piccolo，2018年；Schwendel等人，2015年；Tsiafoulis，2019年）。来自膜脂质氧化的生物标志物（如氧脂素）也显示出潜力（Samarra等人，2021年）。特定化合物，包括肽（Thr-Ala-Val）、D-生物素、三甲胺N-氧化物、木脂素和香豆素，会因品种或饲料不同而有所差异（N?rskov等人，2019年）。微量元素（如钴、铬、铜、碘、硒、锌）也反映了生产方法的影响（Rodríguez-Bermúdez等人，2018年）。

红外光谱技术已被多次用于有机牛奶的验证，但其性能高度依赖于具体背景，当混淆因素（如饮食、季节、“牧场/草饲”标签）影响有机与传统牛奶的区分时，效果会受限。例如，Manuelian等人使用PLS-DA分类方法评估了MIR和Vis/NIR光谱，发现测试准确率较低（MIR约为54%，Vis/NIR约为63%），从而表明单独使用红外光谱不足以完成准确鉴定（Manuelian等人，2021年）。相反，使用PLS-DA的农场罐体FTIR研究可以达到“可接受”的外部验证性能，但这些研究也指出，区分结果可能更多地反映了饮食/管理方式，而不仅仅是“有机”特征，且当这些因素在不同系统间重叠时，区分效果会下降（Capuano等人，Rademaker等人，van den Bijgaart等人，2014年）。重要的是，多项研究表明，结合额外信息可以提高方法的稳健性：Liu等人比较了便携式/台式NIR与GC脂肪酸分析的结果，发现当包含“牧场”牛奶时，NIR的准确性下降（有时这些牛奶看起来与有机牛奶相似），而脂肪酸分析仍能区分有机牛奶与传统牛奶及牧场牛奶——这说明了结合多种技术可以提高鉴定效果（Liu等人，2018年）。在这种背景下，如NMR与同位素标志物相结合的双平台策略能够提高整体性能（Erich等人，2015年；Xu等人，2021年）。

然而，许多研究依赖于来自同质人群的有限样本，这限制了结果的普遍性。

尽管人们对食品欺诈的关注日益增加，但目前的方法仍不足以提供可靠的、内在的有机产品验证。大多数方法依赖于行政数据或有限的成分标志物。迫切需要基于科学的工具来揭示有机农业的生化效应。

我们的研究解决了四个关键问题：（1）缺乏适用于各种食品类型的经过验证的有机来源验证工具；（2）对有机农业生化效应的理解不足；（3）农业实践与可测量标志物之间的关联较弱；（4）未能整合多源数据。

我们采用了一种非靶向光谱方法（¹H-NMR）和多稳定同位素分析（¹³C、¹⁸O、¹⁵N、²H-IRMS），开发了一种全国性的UHT牛奶分类模型。这一工作流程为监测欧盟市场上的有机牛奶真实性提供了可扩展的工具。

部分内容摘录

样本选择与准备

本研究重点关注经过均质处理和超高温灭菌（UHT）处理的有机和传统牛奶的采样。由于项目过程中遇到的保存挑战，本研究未考虑原始牛奶。

采样时间跨度为2021年10月至2023年9月，以考虑年际间的差异。同时考虑了季节性因素，全年进行了采样（春季-夏季采集了276个样本，秋季-冬季采集了136个样本）

结果与讨论

本研究共分析了412个样本：343个已知来源的牛奶样本（158个有机样本，标记为“o”，185个传统样本，标记为“c”）以及来自欧洲市场的69个样本（34个有机样本，35个传统样本）。这些UHT牛奶样本通过IRMS和¹H-NMR进行了分析。样本的详细信息（数量、来源、类型）详见补充材料。

我们的方法效果通过以下三个标准进行了评估：（1）特异性（正确识别有机样本的概率）

结论

本研究提出了一种综合性的分析策略，结合了稳定同位素比率质谱法（IRMS）、质子核磁共振（¹H-NMR）光谱、化学计量建模和人工智能技术，用于区分有机和传统UHT牛奶。

CRediT作者贡献声明

莱斯·拉卡尔（Lyes Lakhal）：软件开发、方法论设计、数据分析、数据管理。多米尼克·贝特朗（Dominique Bertrand）：软件开发、方法论设计、数据分析、数据管理。罗多尔夫·维达尔（Rodolphe Vidal）：方法论设计、概念框架构建。埃里克·贾明（Eric Jamin）：撰写、审稿与编辑、验证工作、资源协调、项目管理、方法论指导。让-弗朗索瓦·莫兰（Jean-Fran?ois Morin）：项目监督、资源协调、资金获取、概念框架构建。埃马纽埃尔·巴科尼埃（Emmanuelle Baconnier）：撰写、审稿与编辑、资源协调。索莱娜·茹尔德伦（Solène Jourdren）：撰写

未引用参考文献

Hastie等人，2009b；Kruskal和Wallis，1952；经合组织，2020；Savorani等人，2013；Tsiafoulis等人，2019。

数据可用性声明

可向第一作者和/或通讯作者索取数据。

资助信息

TOFoo?项目得到了法国政府的支持，属于法国2030计划的一部分，由Bpifrance公司负责实施。项目编号：3895536。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益和个人关系：

克里斯托夫·B.Y. 科尔德拉和弗雷迪·托马斯（Christophe B.Y. Cordella & Freddy Thomas）表示获得了BPI-France的财务支持。如果还有其他作者，他们声明自己没有可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

作者衷心感谢Bpifrance公司为该项目提供的杰出资助。同时，他们也感谢所有来自动物和植物生产领域的专业合作伙伴，感谢他们通过产品供应和专业知识为项目做出的贡献：Biolait、Eurial、Triballat Noyal、AOPn Tomates et Concombres de France、Bonduelle、Carottes de France、Lesieur、Biofournil、Minoterie Suire、C?teaux Nantais、Nicolas、SGF、Pronatura等。