自20世纪40年代以来，由于抗生素具有卓越的抗菌效果，它们在医学、畜牧业和农业中得到了广泛应用（Majdinasab, Mishra, Tang, & Marty, 2020）。其中，氨基糖苷类抗生素由两个或多个通过糖苷键连接的氨基糖组成，通过靶向核糖体并抑制蛋白质合成来发挥杀菌作用（Mingeot-Leclercq, Glupczynski, & Tulkens, 1999）。奈替米星是一种代表性的氨基糖苷类抗生素，具有强大的抗菌活性，被广泛用于管理牲畜的细菌感染以及调节动物的生理功能（Campoli-Richards, Chaplin, Sayce, & Goa, 1989; Adams, Puelings, Rafiee, Roets, et al., 1998）。然而，奈替米星的过度使用会导致其在动物组织中的积累（Campista-León, Rivera-Serrano, Garcia-Guerrero, & Peinado-guevara, 2021）。此外，由于其高水溶性，奈替米星可以通过排泄轻易进入环境，进而污染土壤和水生环境（Gros, Mas-Pla, Sànchez-Melsió, ?eli?, et al., 2023）。研究表明，传统的废水处理过程在消除奈替米星残留方面效果不佳，导致其在自然水系统中持续存在（Batt, & Aga, 2005）。通过食物链或受污染的饮用水长期接触奈替米星可能对人类健康造成严重风险，包括肾毒性、耳毒性和神经毒性（Cui, Zhang, Wang, Huang, et al., 2018; Federspil, 1976）。鉴于这些担忧，开发高灵敏度、选择性和高效的分析方法以检测实际食品样本中的奈替米星残留对于确保公共健康和生态安全至关重要。
目前可用于检测奈替米星的方法主要包括毛细管电泳（Yang, Yu, & Chen, 2001）、高效液相色谱（HPLC）（Arul, Shrina, & Abu, 2010）、薄层色谱（Hubicka, Krzek, Woltyska, & Stachacz, 2009）和液相色谱-质谱（LC–MS）（Tao, Chen, Yu, Huang, et al., 2012）。尽管这些传统技术可以定量测定奈替米星，但它们在实际应用中存在若干局限性（Singh, Thakur, Bhardwaj, Khatri, et al., 2023）。通常，它们需要劳动密集型和耗时的样品预处理步骤，包括提取、纯化和富集步骤，这增加了操作复杂性和总体成本（Das, Chakraborty, Mandal, Mondal, et al., 2025），并且通常不适合现场或实时监测（Mehlhorn, Rahimi, & Joseph, 2018; Lai, Shang, Duan, Ding, et al., 2025），使得在复杂的环境或生物基质中检测微量奈替米星变得具有挑战性。
适配体是通过一种称为指数富集的配体系统进化（SELEX）的有效体外筛选过程选择的单链DNA或RNA寡核苷酸（Nikolaus, & Strehlitz, 2014）。这些核酸分子采用独特的三维构象，能够与多种目标相互作用，包括蛋白质、小分子、细胞和金属离子，具有显著的亲和力和选择性（Liu, Deng, Li, Chow, et al., 2022）。与传统抗体相比，适配体具有多个优势，包括易于合成、生产成本低和更好的物理化学稳定性（Stangherlin, Lui, Lee, & Liu, 2025）。此外，它们的低免疫原性增强了生物相容性。而且，适配体还可以通过化学修饰和结构优化进行精确工程化，使其成为高度多功能的功能探针（Yu, Alkhamis, C, Liu, et al., 2021）。
因此，将奈替米星特异性适配体与多种分析策略结合使用可以促进奈替米星的检测。在一个典型的比色测定中，使用奈替米星适配体作为选择性识别元件，同时引入目标回收和链置换DNA聚合反应来生成丰富的激活剂DNA，这随后触发了CRISPR-Cas12a系统的附带切割活性，释放出NMOF-Pt纳米酶，催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）的显色反应，以实现奈替米星的检测（Jiang, Qi, Khan, Dong, et al., 2024）。另一种方法是基于类囊体的策略，用于制造具有增强比表面积的多孔微针，以便高效固定奈替米星适配体，其中适配体与SYBR Green I之间的相互作用实现了基于荧光的奈替米星定量（Huang, Xu, Wan, Zhu, et al., 2024）。尽管这些方法将适配体与传统的检测技术结合使用以实现奈替米星的监测，但它们存在检测时间长、灵敏度有限和操作复杂的问题。相比之下，基于荧光适配体的传感器因其高选择性、显著灵敏度和快速响应以及易于设计而成为有前景的替代方案（Liu, Yang, Lin, Zhang, et al., 2025）。值得注意的是，当与基于DNA的核酸扩增策略结合使用时，这些传感器可以显著提高分析灵敏度（Wei, Zhu, Cheng, Gao, et al., 2024）。
CHA是一种无需酶的信号放大技术，基于脚手架介导的链置换反应（TSDR），在生物分析和纳米技术应用中显示出巨大潜力（Luo, Li, Zhang, He, et al., 2022）。与传统核酸扩增技术（如聚合酶链反应（PCR）和RCA）相比，CHA具有多个显著优势（Liu, Zhang, Xie, Zhao, et al., 2019）。它可以在温和的等温条件下操作，无需酶或热循环，从而简化实验程序，降低成本，并减少对复杂仪器的依赖（Tian, Zhou, Zhang, Wu, et al., 2022; Wu, Fu, Shi, & Chen, 2021）。这些特性使得CHA特别适合构建生物相容性和可编程的DNA自组装系统以实现信号放大。然而，传统的CHA系统由于内在的动力学限制，通常扩增效率较低。在均匀溶液中，发夹探针分布随机，导致有效局部浓度低和反应物之间的碰撞频率降低（Zhang, Yang, He, Zuo, et al., 2022）。这导致反应动力学降低和信号增益不足（Bai, Yan, Li, Fan, et al., 2022）。最近的进展通过将回文序列整合到发夹结构中解决了这些限制（Li, Yang, Gan, Yuan, et al., 2022; Gong, He, Li, Chen, et al., 2022）。这些对称基序促进了探针通过互补碱基配对自发自组装成局部富集的纳米结构域，从而显著增强了反应物种的接近性和有效浓度（Xie, Li, Gong, Zhang, et al., 2023）。这种结构富集加速了杂交动力学，缩短了整体反应时间，并提高了扩增效率。此外，合理预锁定回文序列在CHA系统中已被证明可以有效抑制非特异性杂交，减少背景噪声，并增强级联信号放大（Gong, Li, Zhang, Zhang, et al., 2024）。这些发现共同为扩展基于CHA的平台的生物传感、临床诊断和环境监测的实用性提供了高的理论和技术潜力。
在这项研究中，我们报道了一种基于适配体的荧光生物传感器，能够通过合理设计的回文约束自复制DNA发夹组装级联放大策略实现奈替米星的高灵敏度检测。当适配体在双链探针中特异性识别奈替米星时，单链DNA启动子被释放，随后触发三个合理设计的发夹之间的CHA反应，导致发夹中预约束的回文序列依次解锁。这些暴露的回文区域发生邻近杂交，驱动基于Y形DNA结构的互连纳米结构DNA组装体的形成，从而展开荧光淬灭的信号发夹。此外，DNA组装体再次结合预先锁定的启动子序列发夹，诱导CHA反应以级联方式继续进行，导致许多信号发夹的展开，实现高度放大的荧光恢复，从而实现超灵敏和高度特异的奈替米星检测。
