基于鱼糜的食品，如鱼丸、蟹棒和虾饼，由于经过密集加工（通常涉及多种物种的混合以及可识别形态特征的丧失），特别容易受到掺假和错误标注的影响（Giusti, Armani, & Sotelo, 2017）。这些高度加工的海产品对追溯性和消费者透明度提出了独特的挑战，因为它们通常由粉碎的鱼浆制成，经过多阶段的机械绞碎、反复清洗和热凝胶化处理。一项全球性 meta 分析估计海产品的错误标注率为19%（Luque & Donlan, 2019），但基于鱼糜的食品的错误标注率可能更高，最近的中国电子商务调查显示错误标注率高达61.9%（Zhang et al., 2024）。
工业化的鱼糜生产过程去除了用于视觉物种识别的形态特征（Park et al., 2013）。因此，针对线粒体DNA的分子方法已成为此类产品物种鉴定的最可靠和实用的方法，为监管执法和欺诈检测提供了依据（Filonzi et al., 2021; Mottola et al., 2024）。通常，DNA条形码技术（通常针对线粒体标记物，如细胞色素c氧化酶亚基I（COI））已成为海产品鉴定的标准方法，因为它具有较高的物种间变异性，并且有丰富的参考数据库（Fernandes et al., 2021; Hebert et al., 2003）。其广泛应用有助于在全球供应链中识别错误标注的海产品（Dawan & Ahn, 2022）。然而，当应用于鱼糜等高度加工的样品时，这种标准的COI条形码效果大打折扣（Zhang et al., 2024）。生产过程中的热应力和机械应力会将DNA剪切成较短的片段，阻止全长条形码的扩增（Galal-Khallaf et al., 2016）。这种降解导致标准PCR协议的模板可用性降低，从而降低了物种鉴定的成功率。为此，一些研究提出了截短或mini-barcode的COI区域，以提高降解样品中的扩增成功率（Sultana et al., 2018）。然而，这些较短的COI条形码的表现可能不稳定，尤其是当引物不匹配或COI序列差异较小时，可能导致假阴性结果和分类分辨率不足。
作为一种替代方案，片段化的线粒体16S核糖体RNA（rRNA）标记物已成为海产品鉴定的有希望的工具，尤其是在鱼糜等高度加工的产品中（Giusti et al., 2023）。这些标记物通常针对较短的扩增子，更有可能在恶劣的加工条件下存活，并且通常具有更广泛的分类用途，能够在一次检测中捕捉到更多的脊椎动物和无脊椎动物，这在处理鱼丸、蟹棒和虾饼等复杂的多物种样品时特别有利（Giusti, Tinacci et al., 2017; Hossain et al., 2019）。因此，关于加工海产品的研究表明，16S标记物比COI标记物能鉴定出更多的物种，从而提供更全面的产品成分评估（Shu et al., 2021）。尽管有这些优势，但在同一组降解的多物种商业鱼糜产品上对这两种标记系统进行系统和定量的对比仍然有限。这样的对比对于理解标记物的特定偏差以及指导常规监管和法医应用中的标记物选择至关重要。
因此，开发稳健、可扩展且快速的鱼糜物种鉴定工作流程对于保护消费者和监管执法至关重要，尤其是考虑到加工海产品中错误标注的高发率（Detcharoen et al., 2024）。便携式测序平台（如Oxford Nanopore Technology（ONT）的进步现在实现了现场实时测序，为现场和监管环境中的快速诊断提供了前所未有的灵活性。虽然ONT可以生成覆盖整个条形码区域的读段，但长读段测序的实际效益取决于剩余DNA模板的完整性和长度，这在鱼糜等高度加工的样品中是一个重要限制。此外，ONT支持实时碱基调用，允许在不需要批量处理的情况下即时分析目标扩增子（Shum et al., 2024）。因此，ONT主要适用于在降解的鱼糜样品中快速、便携地应用长扩增子和短扩增子16S及COI标记物。
在这里，我们使用Oxford Nanopore测序和基于k-mer的分类工作流程，对四种线粒体引物对进行了探索性比较评估，这些引物针对16S和COI基因的长短区域。我们的目标是（1）评估不同标记物的物种鉴定灵敏度和分类精度，（2）量化标记物的特定偏差，（3）为高度加工海产品的监管鉴定提供基于证据的推荐。通过填补这一关键知识空白，我们的研究旨在推动整个鱼糜供应链的透明和可持续实践。
