在优化鹰嘴豆发芽过程中，丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶的作用提高了生物活性肽的生成量

《Food Research International》：Action of serine, cysteine, and aspartate proteases during optimized chickpea germination improved the generation of bioactive peptides

鹰嘴豆发芽通过响应面法优化温度（35℃）和pH（7.0），显著提升可溶性蛋白（33.6%）和蛋白酶活性（1.4倍），释放的低分子量肽对DPP-IV抑制活性增强5倍（IC50从16.31降至3.40 mg/mL），且总蛋白提取物具有COX-2抑制活性（IC75=0.158 mg/mL），为功能性食品开发提供新途径。

　　

埃弗顿·里贝罗（Everton Ribeiro）|佩德罗·恩里克·弗雷塔斯·卡迪内斯（Pedro Henrique Freitas Cardines）|埃尔维拉·冈萨雷斯·德·梅希亚（Elvira Gonzalez de Mejía）|泰丝·德·索萨·罗查（Thais de Souza Rocha）

巴西朗德里纳州立大学食品科学与技术系，邮编86057-970，朗德里纳，帕拉纳州

摘要

鹰嘴豆发芽是一种经济高效的生物活性肽生产方法；然而，最大化蛋白水解和生物活性的最佳温度和pH条件尚未明确。本研究评估了发芽过程中不同pH和温度条件对蛋白酶活性及所得肽的生物活性的影响。通过采用2^3全因子实验和表面响应方法，确定最佳条件为35°C和pH 7.0，在此条件下，48小时发芽后可溶性蛋白含量为33.6%，蛋白水解活性增加了1.4倍。酶抑制实验表明，丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶负责储存蛋白的水解，其在pH 6.0–7.0和35°C时活性最高。蛋白质分离物的电泳结果显示，白蛋白和谷蛋白易于水解，而球蛋白衍生的肽占主导地位。这些肽在体外表现出强烈的二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制活性，在完全结肠消化后其抑制效力提高了五倍以上（IC50从16.31 mg/mL降至3.40 mg/mL）。计算机模拟分析也进一步支持了这一结果（A值=0.50–0.78），突显了它们在管理2型糖尿病方面的巨大潜力。此外，总蛋白提取物还表现出环氧化酶-2（COX-2）抑制活性，在消化前（IC75=0.158 mg可溶性蛋白/mL）的抑制效果优于消化后（IC75=0.434–0.465 mg可溶性蛋白/mL）。这些发现表明，优化后的发芽过程能有效释放具有抗炎和抗糖尿病特性的肽。该过程的可扩展性为其在功能性食品成分生产中的工业应用提供了可能。

引言

植物蛋白市场，尤其是豆类蛋白市场正在快速增长，与2022年相比增长了8.3%，预计到2029年的复合年增长率为7.5%（Market & Markets，2024）。这一增长不仅反映了人口饮食模式的变化，也反映了重新调整食品供应链的需求，特别是在寻找新的蛋白质来源和重新评估现有蛋白质提取方法的有效性方面（Banach等人，2023；Colgrave等人，2021）。

在豆类中，鹰嘴豆是一种全球广泛种植的高价值作物，年产量仅次于普通豆类，达到1650万吨（FAO，2023）。鹰嘴豆营养丰富且用途广泛，可直接用于食品制备或通过工业加工成为食品成分。从成分上看，鹰嘴豆含有约20%的蛋白质，其中约60%为球蛋白，25%为谷蛋白，12%为白蛋白，3%为醇溶蛋白（Di Francesco等人，2024；Herrera & Gonzalez de Mejia，2021）。此外，鹰嘴豆含有多种能够调节与2型糖尿病（T2D）、炎症反应和癌症等非传染性疾病发展相关的生物标志物的肽序列（Gupta & Bhagyawant，2021；Kang等人，2023；Radlowski, Casta?eda-Reyes, & Mejia，2024）。

多种方法可以释放蛋白质中的生物活性肽，包括酶促水解、发芽、发酵和热处理（Ashaolu, Olatunji, Karaca, Lee, & Jafari，2024；Ashaolu & Suttikhana，2023）。发芽是一种经济有效的方法，可以改善许多豆类和谷物的感官和营养价值（Grasso, Lynch, Arendt, & O'Mahony，2022）。在这一过程中，储存在种子组织中的蛋白酶被激活，将蛋白质水解为肽和游离氨基酸，这些物质将被用于新生植物的组织合成（Bera, O’Sullivan, Scaife, Cagney, & Shields，2024）。尽管关于具体机制尚无共识，但研究表明，豆类发芽过程中的蛋白水解涉及C1和C13半胱氨酸蛋白酶、S8和S10丝氨酸蛋白酶以及A1天冬氨酸蛋白酶（He, Huang, Wilson, & Tan-Wilson，2007；Wilson, Chavda, Pierre-Louis, Quinn, & Tan-Wilson，2016；Wilson & Tan-Wilson，2015）。

鹰嘴豆中的生物活性肽主要来自储存蛋白，尤其是vicilins和legumins。然而，豆类球蛋白能够抵抗水解，在胃肠道消化后仍保持完整，从而降低蛋白质的消化率和生物活性。Portari, Tavano和Neves（2005）发现，20°C下发芽6天对球蛋白部分的消化率没有显著影响。虽然发芽使体外消化率提高了10%，但多肽的分子质量保持不变，分别为20、38和55 kDa。另一项研究（Milán-Noris, Gutiérrez-Uribe, Santacruz, Serna-Saldívar, and Martínez-Villaluenga，2018）显示，25°C下发芽5天后可溶性蛋白浓度增加了2.4倍，但约75%的肽无法被肠道吸收，这可能是由于这些蛋白质的β-桶状二级构象结构阻碍了蛋白酶对切割位点的接触。

尽管已有研究表明使用纯蛋白酶或混合蛋白酶可以制备出能够释放生物活性肽的鹰嘴豆蛋白水解物，但关于发芽对酶活性影响的详细研究仍不足。如果能够明确鹰嘴豆发芽过程中蛋白酶的最佳作用条件，通过这一过程获得的蛋白水解物可能有助于提高生物活性肽在胃肠道消化后的释放，从而有益于消费者健康。

因此，本研究旨在评估不同浸泡和发芽条件对鹰嘴豆发芽过程中蛋白酶活性及所得肽生物活性的影响。基于这些研究结果，可以通过简单调整发芽条件来提高食品的生物活性价值，为食品工业提供高蛋白成分的新选择。

材料

2022年11月至12月收获的卡布里鹰嘴豆（Cicer arietinum L.）由Cisbra Agroindustrial LTDA公司（位于巴西南里奥格兰德州Ijuí，坐标28.3783°S, 53.8844°W）提供。这些种子被干燥至含水量为11%，并通过密度计按大小分类。然后使用自动光学选择系统和金属检测器去除杂质和缺陷种子。

猪胃蛋白酶（EC 3.4.23.1，>3200 U/mg）和胰酶（EC 232–468-9，8xUSP，多种成分的混合物）

鹰嘴豆发芽过程中可溶性蛋白浓度的优化

使用线性回归模型（Box等人，2005）研究了浸泡时间、pH值和发芽温度对发芽鹰嘴豆可溶性蛋白含量的影响。关系式可表示为：