《Food Research International》：Ozone and non-thermal plasma as sustainable alternatives to chlorine for decontamination of alfalfa seeds and sprouts
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臭氧、非热等离子体和次氯酸钠可有效灭活高、低剂量污染的苜蓿种子及芽苗中的产毒大肠杆菌，其中氯制剂在低污染水平下灭活效果更优，而臭氧和等离子体在处理后达到相近效果且不损伤产品品质，为可持续的食品微生物安全控制提供新方案。
莫斯塔法·G·阿里 | 梅德·G·阿卜杜勒哈米德 | 艾哈迈德·E·优素福
美国俄亥俄州哥伦布市俄亥俄州立大学食品科学与技术系
摘要
多起食源性疾病暴发与苜蓿芽受到产志贺毒素的大肠杆菌（STEC）污染有关，种子被认为是主要的污染源。这些暴发凸显了需要有效且可持续的种子和芽去污方法。在本研究中，苜蓿种子被接种了高浓度（约10^6 CFU/g）或低浓度（约10^3 CFU/g）的STEC，并分别用非热等离子体（NTP；干式或水雾）、臭氧水溶液（5 ppm）或次氯酸钙（20,000 ppm）处理不超过15分钟。在高浓度STEC接种的情况下，15分钟的处理导致STEC数量减少了1.1–1.7 log CFU/g（p > 0.05），效果较为温和且可比较。相比之下，在低浓度STEC接种的情况下，STEC数量减少了1.6–3.7 log CFU/g，但减少幅度取决于所使用的抗菌处理方法。新鲜制备的苜蓿芽也接受了相同处理，处理时间同样不超过15分钟。结果显示，对于低浓度STEC接种，温和的处理方法（2分钟）比高浓度STEC接种更有效（减少幅度分别为1.0–3.2 log CFU/g和0.5–1.6 log CFU/g）。这些处理方法均未对种子或芽的质量产生不良影响（p > 0.05）。总之，臭氧、NTP和氯都能将苜蓿种子和芽上的高浓度STEC污染降低到相似水平，但在处理前种子中STEC浓度较低时，氯的效果优于臭氧和NTP。如果这些替代技术能在大规模应用前成功优化和验证，预计它们将对环境和健康影响较小，因此具有应用前景。
引言
苜蓿芽因其较短的生产周期、较低的生产成本、高营养价值以及良好的感官特性（如脆爽的口感和轻微的坚果风味）而受到青睐（Rivero等人，2022年）。然而，苜蓿芽的安全性问题引起了行业和消费者的关注。1996年至2016年间，美国发生了48起食源性疾病暴发，都与苜蓿芽污染有关（Gensheimer和Gubernot，2016年）。其中值得注意的暴发包括2016年的Jack & The Green Sprouts大肠杆菌感染事件（CDC，2016a）、2016年的Sprouts Extraordinaire沙门氏菌感染事件（CDC，2016b）以及2011年的Evergreen Fresh Sprouts沙门氏菌感染事件（CDC，2011年）。产志贺毒素的大肠杆菌（STEC）和肠沙门氏菌是导致这些感染的主要病原体（CDC，2012年；Harvey等人，2017年；Mohle-Boetani等人，2001年）。苜蓿芽容易受到多种食源性病原体的污染，这可能与生产环境有关——该环境不仅适合发芽，也适合细菌繁殖（Butscher等人，2016年；美国食品药品监督管理局，2024b年）。由于苜蓿芽通常生食，种子或芽组织上存在病原体会对公共卫生构成重大威胁，因此从种子到最终产品的各个生产阶段都需要有效的去污策略（Rivero等人，2022年）。
传统用于新鲜农产品去污的化学物质（如含氯消毒剂）通常只能实现有限的微生物减少效果（2–3 log CFU/g）（Montville和Schaffner，2004年）。此外，这些消毒剂可能对环境和健康产生不良影响。在处理过程中，通常需要持续添加消毒剂以维持目标浓度，并补偿其与新鲜农产品成分反应导致的消毒剂损失（Chen和Hung，2018年；Xiang等人，2019年）。最常用的种子去污方法之一是使用高浓度的含氯化合物，例如次氯酸钙（20,000 ppm），这是美国国家微生物标准咨询委员会（NACMCF，1999年）推荐的。然而，这种消毒方法存在问题：可能产生致癌性的副产物、处理高浓度溶液时存在工人安全风险、需要长时间冲洗以去除残留氯味，以及欧盟国家和有机生产标准对此有所限制（Allende等人，2008年）。目前正在评估具有更强消毒效果和更好环境兼容性的替代技术，以用于种子和芽的消毒（Adhikari等人，2019年；Bang等人，2016年；Buchholz和Matthews，2010年；Millan-Sango等人，2017年；Ngnitcho等人，2017年；Phua等人，2014年；Saroj等人，2006年）。新兴的氧化消毒剂，如臭氧和非热等离子体（NTP），因其能生成具有强抗菌作用的活性氧物种而受到越来越多的关注。这些活性氧物种可以破坏细菌细胞膜、使蛋白质变性并损伤核酸，从而杀死细菌，且不会在产品上留下化学残留物或造成显著的热损伤。
特别是基于臭氧的处理方法，在灭活苜蓿种子和芽上的大肠杆菌O157:H7和单核细胞增生李斯特菌等病原体方面非常有效（Sharma、Demirci、Beuchat和Fett，2002年；Sharma、Demirci、Beuchat和Fett，2003年）。臭氧的强抗菌性能及其分解后不会产生有害残留物，使其成为传统消毒剂的可持续替代品（Güzel-Seydim等人，2004年）。臭氧处理的多种参数（如浓度、接触时间和种子预浸泡）会影响其消毒效果。同样，NTP作为一种低温、常压下的抗菌技术也受到了广泛关注。等离子体是一种完全或部分电离的气体，通过在活性电极上施加高电压并在选定工作气体存在下生成，从而产生活性氧和氮物种（RONS）、紫外线、光子和其他带电粒子，这些物质协同作用以灭活微生物。不同的气体（空气、氧气和氮气）可用于生成NTP（Bafoil等人，2018年；Kaushik等人，2019年；Royintarat等人，2019年）。在NTP生成过程中，释放的活性物种（如臭氧、过氧化氢、羟基自由基（HO•）、过氧氢自由基（HO2•）、超氧阴离子（O2?）和氮氧化物（NO2/NO3）被认为是微生物灭活的主要机制（Ikawa等人，2010年；Surowsky等人，2015年）。NTP已被用于多种食品基质的去污，包括苜蓿种子（Butscher等人，2016年）和萝卜种子（Puligundla等人，2017年）。此外，NTP还能促进种子发芽、增强种子活力和抗氧化酶活性，显示出其作为去污和促进种子生长的双重潜力（Feng等人，2018年；Holc等人，2022年；?erá等人，2021年）。
尽管之前已有研究探讨了臭氧和NTP在种子和芽去污中的应用，但很少有研究系统地评估在不同条件下接触时间和初始污染水平（低浓度 vs. 高浓度）对其消毒效果的影响。这一知识空白尤为重要，因为苜蓿芽的天然污染通常处于较低水平，而挑战性研究中往往使用高浓度接种。了解这一污染范围内的效果有助于实际应用这些技术。因此，本研究旨在评估臭氧水溶液和NTP对不同STEC污染水平的苜蓿种子和芽的去污效果。同时，还评估了这些处理方法对发芽结果和芽颜色质量的影响。研究结果旨在支持开发可持续、无残留的技术，以确保发芽种子的微生物安全。
细菌菌株
本研究中使用了一种抗抗生素的报告菌株，该菌株源自产志贺毒素的大肠杆菌O157:H7 EDL933（Ali等人，2025年）。EDL933菌株最初与1982年美国一起出血性大肠杆菌暴发有关，该暴发与受污染的碎牛肉有关（Riley等人，1983年）。该报告菌株能够在苜蓿芽生产过程中生长（Ali等人，2025年），其四环素抗性（tet+）有助于其在该环境中的存活。
臭氧水溶液处理及苜蓿种子和芽上的STEC菌群
使用臭氧水溶液处理受低浓度（约10^3 CFU/g）或高浓度（约10^6 CFU/g）STEC污染的种子或芽时，显著降低了病原体数量（图2）。在低浓度接种情况下，未经处理的种子中的STEC数量为2.9 log CFU/g，而经过2分钟、10分钟和15分钟臭氧处理的种子中STEC数量分别降至1.5 log CFU/g、1.4 log CFU/g和1.4 log MPN/g（图2A）；因此，处理使STEC数量减少了1.4–1.5 log CFU/g。
结论
根据本研究，臭氧水溶液和NTP处理为减少苜蓿种子和芽上的STEC污染提供了有效且无残留的替代方案。尽管次氯酸钙仍然是种子和芽去污的金标准，但相对温和的臭氧和等离子体处理方法也能实现类似的STEC减少效果，尤其是在中等污染水平下，适用于实际的食品安全应用。
作者贡献声明
莫斯塔法·G·阿里：撰写原始稿件、方法设计、实验设计、数据分析、数据整理。
梅德·G·阿卜杜勒哈米德：撰写修订稿件、数据可视化、实验监督、数据分析、概念构思。
艾哈迈德·E·优素福：撰写修订稿件、实验监督、资源调配、项目管理、资金筹集、概念构思。
资助
本工作得到了Virginia Hutchinson Bazler和Frank E. Bazler基金的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
