共培养的鱼类细胞球体可作为人工鱼肉制作的构建模块

《Food Research International》：Co-cultured spheroids of piscine cells as building blocks for cultured fish meat

培养肉通过三维共培养系统成功构建兼具肌原细胞和脂肪细胞的仿生组织，不同PSCs与PADSCs比例（5:5、7:3、9:1）均保持高存活率并实现定向分化，基因表达分析显示其特征介于单一细胞系之间。

　　

苏英飞|张胜亮|江英琪|徐恩波|刘东红|陈启和

浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州 310058，中国

摘要

培养肉已成为提高全球食物可持续性的有前景的方法。然而，目前的生产方法主要依赖于单细胞培养，这无法复制传统肉类的复杂组成。在这项研究中，建立了一种无支架的共培养系统，以生成包含高度分化的肌肉和脂肪细胞的结构化微组织。研究了鱼源脂肪干细胞（PADSCs）与鱼源卫星细胞（PSCs）比例为5:5、7:3和9:1的共培养球体，结果显示所有比例在整个分化过程中都保持稳定且具有高活力，并成功诱导形成了含有肌管和脂肪细胞的仿生组织。基于转录组数据，聚类分析表明，PADSCs与PSCs比例为7:3的共培养球体与PADSCs球体相似，细胞周期相关和细胞外基质相关基因的表达水平更偏向于PADSCs球体。这些结果表明，这些共培养球体作为进一步组织组装的构建块具有潜力，并为扩大结构化培养鱼肉的生产提供了有前景的方法。

引言

海鲜富含高质量的蛋白质、必需氨基酸、多不饱和脂肪酸、各种维生素和矿物质，是人类饮食的重要组成部分（Tripathi, 2023）。过去几十年里，全球对海鲜的需求大幅增加，人均年消费量从1961年的9.1公斤增加到2022年的20.7公斤（联合国粮食及农业组织，2024）。这种消费增长导致了过度捕捞和水产养殖的扩张，进而引发了水生生态系统退化、生物多样性丧失、气候变化、人类健康风险和动物福利问题（Malerich, 2022）。为应对这些挑战，通过体外细胞培养技术生产的培养肉（CM）被提出作为一种可持续的替代方案，有望弥补供应缺口并支持行业的绿色转型（Chandimali, 2024）。

鱼的可食用部分主要由骨骼肌组成，骨骼肌通常由肌肉纤维（约占90%）、脂肪和结缔组织构成（Wang等人，2024）。肌肉纤维的大小和数量以及肌内脂肪含量和脂质组成会影响肉的外观、嫩度、多汁性和风味（Listrat等人，2016）。生产在营养价值和感官特性上与传统肉类相似的组织仍然具有挑战性（David等人，2023）。当前单细胞培养系统的主要局限性在于其结构过于简单。在这些系统中，不同的细胞群体分别培养和分化后再进行组合，这往往导致产品缺乏真实肉类的结构复杂性。相比之下，共培养系统可以通过同时培养多种细胞类型来发展更复杂和真实的肌肉-脂肪组织结构。尽管这项技术在组织工程和药物递送领域得到了广泛研究，但其应用于CM生产仍处于起步阶段（Pallaoro等人，2023；Pierezan & Verruck, 2024）。

传统的二维（2D）细胞培养操作简单，但无法复制真实组织中的三维（3D）结构和细胞-细胞相互作用。相比之下，3D培养系统更准确地模拟了体内微环境，有助于组织结构的发展（Dave等人，2025）。目前的CM生产方法主要依赖支架来复制细胞外基质（ECM）的功能，并支持细胞粘附、增殖和分化。然而，开发理想的支架材料仍然具有挑战性，因为这需要优化多个参数，包括机械强度、孔隙率和细胞粘附效率，同时还要平衡可食用性、低成本和大规模生产的可行性（Chen, 2022；Chen等人，2024）。另一种3D培养方法不需要任何支架，简化了生产过程并避免了潜在的食品安全问题。在这种无支架的方法中，细胞在非粘附表面上培养并被迫靠近（Klatt等人，2024）。在细胞-细胞和细胞-ECM相互作用的驱动下，单个细胞会自发聚集形成多细胞球体（Decarli等人，2021）。利用适当的食品结构技术，这些球体可以组装成更大、更复杂的组织结构（Heinze等人，2025）。因此，球体作为CM的构建块具有便利性、简单性和优越性。

大黄鱼（Larimichthys crocea）是中国东南沿海重要的商业海洋物种，其肉质细腻且营养价值高。由于长期过度捕捞导致野生资源迅速减少，现在主要依赖水产养殖（Liu & de Mitcheson, 2008）。在这项研究中，我们开发了一种3D悬浮培养系统，使用从大黄鱼中分离出的鱼源卫星细胞（PSCs）和鱼源脂肪干细胞（PADSCs）来形成球体。通过调整初始细胞密度来调节球体直径，以确保有效传递质量。然后，培养了含有不同比例PSCs和PADSCs的共培养球体，并分析了它们对最终肌细胞和脂肪细胞生成的影响，包括通过活/死染色评估细胞状态和通过荧光染色评估分化潜力。结果显示，不同比例的共培养球体表现相似，都能良好地增殖和分化。最后，使用转录组测序技术在基因水平上分析了这些现象。无论是ECM相关基因还是细胞周期相关基因，共培养球体中的表达水平都介于PSCs球体和PADSCs球体之间。这表明共培养球体可以用作CM的构建块。

部分内容摘录

细胞分离

分离、鉴定和培养PSCs的方法已在先前的研究中描述过（Zhang等人，2023）。PADSCs是根据Xu等人（Xu, 2023）描述的方案分离的。首先用0.1%的IV型胶原酶（Gibco，纽约，美国）在室温（RT）下消化大黄鱼的腹部脂肪组织1小时，然后用0.1%的胰蛋白酶-EDTA（Xapunu，杭州，中国）消化20分钟。消化后，细胞依次通过70微米和40微米的过滤器进行过滤

原代细胞的分离和鉴定

种子细胞的获取和培养至关重要，因为它们是组织生长的基础，决定了CM产品的质量、质地和产量（Olenic等人，2025）。肌肉再生主要由卫星细胞（SCs）驱动，卫星细胞可以增殖并分化为肌母细胞、肌细胞和多核肌管（Le Grand & Rudnicki, 2007）。从脂肪组织中分离出的脂肪干细胞（ADSCs）可以增殖并分化为脂肪细胞（

讨论

为了使CM的质地、营养和风味类似于真实肉类，有必要进行多种细胞类型的3D共培养。在各种3D培养模型中，不依赖支架的多细胞聚集体已在不同领域得到广泛应用（Goel等人，2023）。在这项研究中，建立了一种无支架的3D共培养系统，实现了PSCs和PADSCs的共同增殖和分化。通过利用细胞自我组装和细胞间相互作用

结论

综上所述，我们使用从大黄鱼中分离出的PSCs和PADSCs开发了共培养球体。通过改变初始细胞接种密度来调节球体的直径，最终确定含有5×10^4个细胞的球体对结构稳定性和细胞存活最为有利。基于此，培养并分化了含有不同比例PSCs和PADSCs的共培养球体。细胞状态

CRediT作者贡献声明

苏英飞：写作——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、软件、资源、项目管理、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。张胜亮：可视化、方法学、研究、数据管理。江英琪：软件、方法学。徐恩波：软件、方法学。刘东红：方法学、概念化。陈启和：写作——审阅与编辑、可视化、监督、资源、项目

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（编号2024YFE0197500）、浙江省中央科技发展基金（编号2025ZY01010）以及浙江大学上海高等研究院农业科技重大项目与星空科学基金（编号SN-ZJU-SIAS-004）的资助。