建立一种ELISA检测系统，用于测定硬骨鱼类体内的垂体激素水平

荧光竞争ELISA方法成功开发并验证，可同步定量青鱼生长激素（GH）、促乳素（PRL）、somatolactin alpha（SLα）和beta（SLβ），灵敏度高（ID50 8.004-18.63 ng/mL），适用于血浆和细胞培养液检测，为青鱼生长调控、繁殖管理和应激研究提供新工具，且方法可推广至其他鲤科鱼类。

　　

曾向通|欧阳宇|史旭涛|韩长青|柯亮|高银爱|刘向江|杨静|杨凯|胡光福

华中农业大学渔业学院，中国武汉430070

摘要

我们开发并验证了一种基于荧光的竞争性酶联免疫吸附测定（ELISA）方法，用于同时定量草鱼（Ctenopharyngodon idella）中的四种关键垂体激素：生长激素（GH）、催乳素（PRL）、生长激素α亚型（SLα）和生长激素β亚型（SLβ）。该测定使用重组草鱼激素作为标准品，并配备相应的兔多克隆抗体，通过生物素-亲和素-HRP放大技术和HPPA荧光检测系统进行检测。标准曲线显示高度线性，半数抑制浓度（ID₅₀）范围为8.004至18.63 ng/mL。我们成功将此ELISA方法应用于检测在GHRH、SST、皮质醇和CRH刺激后原代垂体细胞培养物中的激素水平，证实了其能够检测生理相关变化。这种可靠、灵敏且成本效益高的ELISA方法为监测草鱼的内分泌状态提供了有价值的工具，具有在生长性能评估、繁殖管理和水产养殖应激反应研究中的潜在应用价值。由于这些激素的序列高度保守，该方法也可能适用于其他鲤科鱼类。

引言

生长激素/催乳素（GH/PRL）家族起源于一个共同的祖先基因，并在脊椎动物进化过程中通过复制事件而多样化（Wallis, 1992）。在硬骨鱼类中，GH、PRL和生长激素（SL）构成了一类由垂体主要产生的螺旋状细胞因子，它们调节生长、代谢、渗透调节、繁殖、免疫功能和环境适应（Huising et al., 2006, Forsyth and Wallis, 2002, Whittington and Wilson, 2013）。因此，垂体作为中枢内分泌调节器，整合内部和外部信号以维持生理稳态（Berczi, 1997, Kawamura et al., 2002）。

GH是调控体细胞生长和代谢的关键因素，通过两种同源受体（GHR1和GHR2）发挥作用（Saera-Vila et al., 2005）。GH与GHR结合后激活JAK2-STAT、PI3K-Akt和MAPK信号通路，促进蛋白质合成、骨骼肌肉发育和营养代谢（Argetsinger et al., 1993, Brooks and Waters, 2010, Dehkhoda et al., 2018）。GH还刺激肝脏和肝外组织产生IGF-1，形成GH/IGF-1轴，从而间接调控生长（Yakar et al., 1999, Le Roith et al., 2001, Wood et al., 2005）。除了促进生长外，GH还参与免疫调节、组织修复和繁殖（Berczi, 1997, Forsyth and Wallis, 2002, Yada, 2002, Sun et al., 2011），其分泌受到下丘脑GHRH和生长抑素的调节（Hartman et al., 1993, Zhang et al., 1994, Müller et al., 1999, Tannenbaum et al., 2003）。

PRL是一种多功能的垂体激素，在硬骨鱼类的渗透调节、代谢、免疫和繁殖中起着关键作用（Manzon, 2002, Sakamoto and McCormick, 2006; Whittington et al., 2013; Breves et al., 2020, Zhu and Li, 2024）。在草鱼等淡水物种中，PRL对于维持低渗条件下的离子和水分平衡至关重要。PRL通过PRL受体（PRLR）发挥作用，这是一种I类细胞因子受体，可激活JAK2-STAT5、MAPK和PI3K-Akt信号通路（Bole-Feysot et al., 1998, Bernichtein et al., 2010, Gorvin, 2015）。prl和prlr基因的表达受渗透压、环境盐度、皮质醇和繁殖信号的影响，表明PRL是连接环境适应与生殖生理的内分泌调节因子（A Rojas-Vega et al., 2006; Yamaguchi et al., 2017, Liu et al., 2020, Nagarajan et al., 2023）。

SL是一种特有于硬骨鱼类的垂体激素，包含两种异构体——SLα和SLβ，由不同的基因编码，具有部分不同的功能。SLα与脂质代谢、离子调节、能量平衡和繁殖周期相关，而SLβ对环境压力和免疫挑战更敏感。这两种异构体都参与钙和磷酸盐的稳态调节、色素控制以及长期的环境适应，它们的表达模式表明在鲤科鱼类中具有内分泌以及潜在的旁分泌或自分泌功能（Zhu et al., 2004, Fukada et al., 2005, Benedet et al., 2008; Wan et al., 2010; Sasano et al., 2012, Morioki et al., 2023）。

准确测量GH、PRL、SLα和SLβ对于研究硬骨鱼类的内分泌调节至关重要。早期的生物学测定方法灵敏度较低，但放射免疫测定（Yalow and Berson, 1960）和后来的ELISA（Engvall and Perlmann, 1971）的发展实现了肽类激素的高特异性和高通量定量。现代免疫测定技术由于抗体的改进、信号底物的优化（荧光/化学发光）和基于纳米材料的信号放大技术（Fukada et al., 1997, Lal and Singh, 2005, Wild, 2013）而在精确度上取得了显著进步。这些进展使得ELISA成为分析鱼类垂体激素的强大工具，尤其是在结合物种特异性的抗体开发和优化的测定验证方案时。

草鱼（Ctenopharyngodon idella）是亚洲水产养殖中最重要的经济淡水物种之一。然而，针对哺乳动物的激素测定方法并不总是可以直接应用于鱼类，因为鱼类激素序列、分泌动态和基质效应存在差异。草鱼的GH分泌呈脉冲式，功能研究表明，需要针对硬骨鱼类定制的免疫测定方法才能进行可靠的内分泌分析（Perea and Navarro, 2008, de la Serrana and Macqueen, 2018, Guérineau and Gilles, 2022）。因此，开发一种能够同时定量GH、PRL、SLα和SLβ的物种特异性ELISA对于准确评估草鱼的内分泌状态至关重要。这样的工具将有助于研究生长、代谢、渗透调节、繁殖和应激反应，并可能支持旨在提高生长性能和水产养殖生产力的选择性育种计划。

实验部分

动物与伦理

未成熟的草鱼从华中农业大学附近的水产市场获取，暂时放置在温度为20°C、pH值为7.5±0.2的玻璃水箱中，光照时间为14小时，黑暗时间为10小时。所有实验程序均遵循华中农业大学实验动物伦理委员会的批准指南（批准编号HBAC20091138）。

序列检索与分析

从NCBI和Ensembl中检索了淡水鲤科鱼类的GH、PRL、SLα和SLβ的核苷酸和氨基酸序列。

鲤科鱼类中GH/PRL家族成员的序列保守性和结构分析

通过多重序列比对评估了GH、PRL、SLα和SLβ在鲤科鱼类中的保守性。分析结果显示，草鱼的GH与斑马鱼、银鲤、鳙鱼和普通鲤的直系同源物的氨基酸相似度为83.49%（图1A）。PRL序列的保守性更高，在这五种鱼类中的相似度达到86.77%（图1B）。对于SLα，其在草鱼、斑马鱼和普通鲤之间的序列相似度为88.45%

讨论

在本研究中，我们开发并验证了一种专门用于定量草鱼GH、PRL、SLα和SLβ的竞争性酶联免疫吸附测定（ELISA）方法。该方法在方法学上明显优于异源或基于哺乳动物的试剂盒，后者在应用于硬骨鱼类时常常存在交叉反应和准确性有限的问题。针对物种特异性肽序列定制的免疫测定方法始终优于广谱测定方法

结论

在本研究中，我们成功开发了一种针对草鱼GH、PRL、SLα和SLβ的竞争性酶联免疫吸附测定（ELISA）平台，使用了物种特异性的重组抗原和多克隆抗体。该测定方法具有高灵敏度和强特异性，有助于解决针对硬骨鱼类的激素免疫测定方法有限的问题。

未引用的参考文献

Liu et al., 2006, Wan and Chan, 2010.

CRediT作者贡献声明

曾向通：撰写初稿、方法学设计、数据整理。欧阳宇：资源获取、方法学设计、数据整理。史旭涛：资源获取、数据整理。韩长青：资源获取。柯亮：资源获取。高银爱：资源获取。刘向江：实验研究。杨静：资源获取、资金筹措。杨凯：资源获取、资金筹措。胡光福：撰写、审稿与编辑、监督、资金筹措。

伦理批准

本研究中使用草鱼的过程符合华中农业大学动物护理和使用委员会的指导原则（伦理批准编号HBAC20091138；日期：2009年11月15日）。

资助

本研究得到了湖北省自然科学基金（2023AFD182）、湖北省博士后挑战计划、中央高校基本科研业务费（2662024SCPY001，资助人G.F.H.）、湖北省重点研发项目（2023BBB168）、湖北省优质种子产业发展基金（HBZY2023B009）以及中国农业研究系统（CARS-46）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本文献给香港大学的Anderson O. L. Wong，他对培养年轻的内分泌学领域科学家表现出了真正的兴趣。