《International Journal of Biological Macromolecules》：Postbiotic-assisted synthesis of cerium oxide nanocomposites functionalized with folic acid–chitosan and tea polyphenols for redox-regulated anticancer activity
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三阴性乳腺癌（TNBC）治疗依赖新型纳米复合材料，本研究通过乳酸杆菌提取物生物合成氧化铈纳米颗粒（CeO2 NPs），负载茶多酚（TP）并修饰 folate-壳聚糖（FA-CS），实现pH响应性释放与靶向递送。FA-CS-LG-CeO2-TP纳米复合物在酸性肿瘤微环境中表现出氧化应激诱导的细胞凋亡，对MDA-MB-231细胞存活率降低60%，同时保持正常细胞兼容性及低溶血活性。该生物合成策略结合多功能纳米平台为TNBC治疗提供新方案。
作者：Anbazhagan Sathiyaseelan、Han-Sol You、Sunyoung Park、Myeong-Hyeon Wang
韩国江原国立大学生物健康融合系，春川市，24341
摘要
三阴性乳腺癌（TNBC）是一种具有侵袭性的乳腺癌亚型，其特征是缺乏激素受体和HER2受体，这限制了传统疗法的有效性。在这项研究中，通过将氧化铈纳米颗粒（CeO? NPs）与生物活性成分和靶向成分结合，开发出了一种多功能纳米复合材料，用于选择性治疗TNBC。使用Lactobacillus graminis的细胞外代谢物合成了CeO? NPs，得到了分布均匀且结晶度高的纳米颗粒。随后将茶多酚（TP）负载到CeO? NPs（5.07 ± 1.48 nm）上以增强其氧化还原功能，并通过叶酸共轭壳聚糖（FA-CS）对表面进行功能化处理，以促进细胞对叶酸的摄取。所得的FA-CS-LG-CeO?-TP纳米复合材料在动态光散射（DLS）测量中显示出纳米级均匀性（约270 nm），具有接近中性的Zeta电位以及良好的胶体稳定性。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和X射线衍射（XRD）分析证实了FA-CS的功能化处理成功，且未改变CeO?的晶体结构。该纳米复合材料在pH 5.4时表现出持续的TP释放（约63%），在DPPH和ABTS测试中显示出强抗氧化能力，并且在RAW 264.7和NIH3T3细胞中具有良好的细胞相容性。值得注意的是，FA-CS-LG-CeO?-TP在MDA-MB-231细胞中表现出显著的细胞毒性（存活率降低约60%），这是通过ROS介导的凋亡机制实现的，同时其溶血活性极低（<4%）。这些发现表明，后生物制剂介导的合成结合多酚负载和FA-CS功能化，为选择性氧化还原调控的TNBC治疗提供了一个有前景的纳米平台。
引言
三阴性乳腺癌（TNBC）是最具侵袭性和治疗难度最大的乳腺癌亚型之一，约占所有诊断病例的10-15% [1]。由于缺乏雌激素受体（ER）、孕酮受体（PR）和人表皮生长因子受体-2（HER2）的表达，传统的激素和HER2靶向疗法对TNBC无效。因此，TNBC的治疗主要依赖于全身化疗，但这通常会导致肿瘤选择性差、全身毒性、早期转移以及多重耐药性的产生 [2], [3], [4]。这些限制凸显了迫切需要开发能够选择性靶向TNBC细胞同时最小化正常组织损伤的替代治疗策略。基于纳米技术的方法通过提高药物稳定性、增强细胞摄取以及在肿瘤微环境中的可控释放提供了有希望的解决方案 [5], [6]。在各种纳米材料中，氧化铈纳米颗粒（CeO? NPs）因其独特的Ce3?和Ce??氧化态之间的氧化还原转换能力而受到广泛关注 [7], [8]。这种氧化还原循环使CeO? NPs具有类似酶的活性，包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和氧化酶的功能 [9], [10]。重要的是，CeO?表现出依赖环境的氧化还原行为：在生理条件下具有抗氧化作用，而在酸性和氧化性的肿瘤微环境中则表现出促氧化作用 [11], [12]。这种双重功能使其能够选择性地调节活性氧（ROS），在正常细胞中发挥保护作用，同时在癌细胞中促进氧化应激相关的细胞毒性，这一点对于TNBC尤为重要 [13], [14]。传统的CeO? NPs化学合成方法往往涉及苛刻的反应条件和有毒试剂，这限制了它们的生物医学应用。相比之下，使用益生菌衍生的生物分子进行生物合成是一种可持续且生物相容的替代方法 [15], [16]。Lactobacillus菌株以分泌细胞外蛋白质、肽、多糖和抗氧化代谢物而闻名，这些物质可以调节氧化还原平衡和免疫反应 [17]。这些细胞外分泌物（通常称为后生物制剂）可以在纳米颗粒合成过程中起到天然还原和稳定剂的作用，从而提高材料的生物相容性和表面功能。Lactobacillus介导的生物合成已成功应用于各种金属和金属氧化物纳米颗粒的制备，如Ag、γ-Fe?O?和ZnO [18], [19], [20], [21], [22], [23]。然而，使用Lactobacillus衍生的细胞外提取物直接合成CeO? NPs的研究较少，现有研究大多集中在将分离出的代谢物（如细菌素）结合到预先制备的CeO? NPs上 [24], [25]。这表明在后生物制剂介导的CeO? NPs生物医学应用方面存在明显的研究空白。
为了进一步提高生物合成CeO? NPs的治疗潜力，可以整合天然生物活性分子和基于生物聚合物的表面功能化处理。茶多酚（TP）主要由儿茶素衍生物组成，如表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表儿茶素（EGC）和表儿茶素（EC），据报道它们可以通过调节ROS、影响线粒体功能和诱导细胞凋亡等方式在乳腺癌和TNBC模型中发挥抗癌作用 [26], [27]。然而，由于稳定性差和生物利用度有限，其临床应用受到限制 [28], [29]。将TP整合到具有氧化还原活性的CeO?纳米结构中可以保护TP免受降解，并实现协同的氧化还原调控：TP在癌细胞中诱导氧化应激，而CeO?则在正常细胞中减轻过量的ROS [30]。壳聚糖（CS）是一种天然阳离子多糖，被用作生物聚合物涂层，以改善胶体稳定性、生物相容性和pH响应性释放行为 [31]。叶酸（FA）与CS结合，以便利用许多TNBC细胞中过表达的叶酸受体促进细胞摄取 [32]。需要注意的是，本研究中FA主要作为增强摄取的配体使用，而非作为受体介导靶向作用的直接证据。
因此，我们报道了使用Latilactobacillus graminis细胞外提取物通过后生物制剂介导合成CeO? NPs的方法，随后进行茶多酚负载和叶酸-壳聚糖功能化处理。所得的FA-CS-LG-CeO?-TP纳米复合材料被设计为一个多功能平台，整合了绿色合成、氧化还原活性的CeO?、抗氧化多酚和生物聚合物辅助的细胞摄取增强功能。这项工作为TNBC的氧化还原调控抗癌活性提供了体外概念验证（图1）。
材料
氯化铈（无水，99.5%）购自Alfa Aesar（韩国）。低分子量壳聚糖（50–190 kDa；脱乙酰化程度约为75–85%）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。茶多酚（TP；纯度98.0%，CAS编号84650–60-2）购自上海源业生物科技有限公司（中国上海）。
Lactobacillus细胞外提取物的制备
Latilactobacillus graminis OM327574是从发酵的卷心菜（泡菜）中分离得到的，其16S rRNA序列已确定
TEM分析
使用透射电子显微镜（TEM）研究了益生菌介导的LG-CeO?–TP纳米颗粒及其表面功能化后的对应物（FA-CS-LG-CeO?-TP）的形态和纳米结构（图1、图2）。如图1a–d所示，负载TP的LG–CeO? NPs主要呈球形，平均粒径分布为5.07 ± 1.48 nm；在较低放大倍数下观察到聚集现象。这种聚集现象在乙醇分散和网格条件下常见的超小CeO? NPs中也有报道
结论
本研究报道了一种通过益生菌辅助的绿色合成方法制备的可持续、多功能FA-CS-LG-CeO?-TP纳米复合材料。L. graminis衍生的细胞外生物分子使得无需使用有毒试剂即可形成结晶度高、生物相容性良好的CeO? NPs。后续的茶多酚负载和叶酸-壳聚糖功能化处理使得该纳米复合材料具有pH响应性释放、氧化还原调控能力和增强的细胞摄取性能。
作者贡献声明
Anbazhagan Sathiyaseelan：撰写初稿、可视化处理、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。
Han-Sol You：实验设计、数据分析、数据管理。
Sunyoung Park：撰写修订稿、验证结果、数据分析。
Myeong-Hyeon Wang：撰写修订稿、项目管理、资金获取、数据管理。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了韩国国家研究基金会（2022R1A2C2091029）的支持。
